Die Receptor Interacting Proteins (RIPs) übernehmen als zytoplasmatische Adaptorproteine insbesondere des TNF-Rezeptors Typ I fundamentale Funktionen bei der intrazellulären Feinabstimmung lebenswichtiger Prozesse. Während für RIP4 bereits eine essentielle Rolle bei der embryonalen Entwicklung ektodermaler Gewebe nachgewiesen wurde, war ansonsten über die Bedeutung dieser Proteinfamilie für die Haut sowie deren Wundheilung vor Beginn dieser Arbeit nichts bekannt. Dabei erfordert insbesondere die Verletzung des feinstrukturierten Gewebes der Haut eine komplexe Reorganisation, welche über exakt abgestimmte Mechanismen durch eine Vielzahl beteiligter Zelltypen gesteuert wird. Dies erfolgt in einem hohen Maße über die Freisetzung von Wachstumsfaktoren und Zytokinen, deren Signale über unterschiedliche Rezeptoren in das Zellinnere weitergeleitet werden. Aufgrund der besonderen Bedeutung der Rezeptoren vom TNFR-Typ für den Wundheilungsprozess war es das Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit, die keratinozytenspezifische Bedeutung der RIPs in der Haut sowie bei der Wundheilung zu analysieren. Hierfür wurde zunächst die basale Expression der einzelnen rip-Gene im intakten Hautgewebe sowie deren Regulation im Heilungsverlauf muriner Exzisionswunden untersucht. Bei diesen in vivo-Expressionsanalysen wurde keine Regulation der moderat exprimierten rip-Gene 1, 2 und 5 beobachtet. Demgegenüber ließ sich für das rip3-Gen eine massive Induktion während der inflammatorischen Phase der Wundheilung nachweisen, welche sich in den Zellen des Granulationsgewebes lokalisieren ließ. Hingegen wurde für das in den Keratinozyten der Basalschicht stark exprimierte rip4-Gen eine massive Repression während der frühen Wundheilung beobachtet, die sich in den Keratinozyten des hyperproliferativen Epithels lokalisieren ließ. Darauf aufbauend wurden zudem die Expressionsmuster der rip-Gene unter proliferations- sowie differenzierungsförderlichen Kultivierungsbedingungen von Keratinozyten in vitro untersucht. Auch hierbei ließ sich keine Regulation der Expression der rip Gene 1, 3 und 5 nachweisen, während das Expressionsniveau des rip2-Gens bei HaCaT-Zellen mit deren Proliferationsrate korrelierte, was sich jedoch in primären Keratinozyten nicht bestätigen ließ. Die Expression des rip4-Gens wies hingegen sowohl in HaCaT-Zellen als auch in primären Keratinozyten eine enge Assoziation mit der frühen Differenzierung auf, womit sich bereits andeutete, dass RIP4 an der Regulation der Keratinozytendifferenzierung beteiligt sein könnte. Vor diesem Hintergrund wurde in vitro untersucht, welche Faktoren an der Repression des rip4-Gens in Keratinozyten nach Verwundung beteiligt sein könnten. Dabei konnte nachgewiesen werden, dass sehr unterschiedliche Faktoren, welche größtenteils auch wichtige Regulatoren der Wundheilung in vivo sind, eine Repression der rip4-Genexpression bewirken können: sowohl Serum als auch EGF, TGF-β1, Activin A, proinflammatorische Zytokine und Wasserstoffperoxid führten zu einer Hemmung der rip4-Expression. Diese Hemmung ließ sich jedoch teilweise durch Inhibitoren des Transkriptionsfaktors NF-κB blockieren, wobei sich insbesondere nach Applikation von Dexamethason eine komplette Aufhebung der rip4-Genrepression nach Verwundung in vitro nachweisen ließ. Begleitet wurde diese Dysregulation von einem vollständig unterbleibenden Wundverschluss der Keratinozyten- Monokultur, was auf eine besondere Bedeutung der Regulation der rip4-Expression für die Reepithelisierung nach Verwundung hinweist. Zur näheren Charakterisierung der funktionellen Bedeutung von RIP4 in Keratinozyten wurde schließlich die Expression des rip4-Gens in kultivierten HaCaTZellen mittels siRNA gehemmt. Anschließende Untersuchungen der Keratinozyten zeigten, dass die Hemmung der rip4-Genexpression weder eine veränderte Proliferationsrate noch eine Regulation von proliferationsassoziierten Genen nach sich zog. Demgegenüber ließ sich insbesondere für Gene, welche mit der frühen und mittleren Differenzierungsphase von Keratinozyten assoziiert sind, eine temporär induzierte Expression nachweisen. Zusammen mit den Ergebnissen der in vivo- Analysen zur Lokalisation der rip4-Genexpression im Hautgewebe konnte somit gezeigt werden, dass das RIP4-Protein an der Regulation der frühen Differenzierung von Keratinozyten beteiligt ist. Zudem konnte nachgewiesen werden, dass RIP4 die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB in Keratinozyten bewirkt. Da auch über die Bedeutung von NF-κB für die Wundheilung der Haut vor Beginn dieser Arbeit wenig bekannt war, wurde auch dessen Aktivierung im Verlauf der Wundheilung untersucht. Hierbei konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von NF-κB bei der Wundheilung der Haut einer differentiellen Regulation unterliegt. Insbesondere in Zellen des Granulationsgewebes sowie des hyperproliferativen Epithels ließ sich eine massive Aktivierung nachweisen. Wundheilungsstudien an IκBαDN-Mäusen, in denen die Aktivität des NF-κB auf ein Minimum reduziert ist, zeigten zudem, dass die mangelnde NF-κBAktivierung zu einem ausgeprägten inflammatorischen Wundheilungs-Phänotyp führt, der mit einer verminderten Ausbildung des hyperproliferativen Epithels einhergeht. Ähnlich wie nach Dexamethason- Applikation in vitro führte die eingeschränkte NF-κB-Aktivität zudem auch in vivo zu einer stagnierenden, hohen Expression des rip4-Gens nach Verwundung. Insgesamt konnte somit nachgewiesen werden, dass die Gene, die für die verschiedenen Receptor Interacting Proteins kodieren, in Keratinozyten charakteristische Expressionsmuster aufweisen. Während rip1-3 sowie rip5 größtenteils lediglich moderat exprimiert und nicht reguliert werden, unterliegt das rip4-Gen einer komplexen Regulation und übernimmt in Keratinozyten eine bedeutende Funktion sowohl bei der Reepithelisierung nach Verwundung als auch bei der epidermalen Differenzierung.
Receptor Interacting Proteins (RIPs) were initially identified as adapter proteins of the intracellular domain of members of the TNFR I family. Meanwhile, they are known to be crucial integrators of intracellular vital processes and central regulators of cell proliferation and differentiation. Although a previous publication could demonstrate that RIP4 is an important modulator of ectodermal tissue formation during embryonic development, nothing was known about a potential role of the RIP proteins in cutaneous wound healing and epidermal differentiation at the beginning of our study. Cutaneous wound repair requires a tight and coordinated regulation of various different processes, such as cell proliferation, differentiation, and migration. This egulation is performed by a complex system of growth factors and cytokines, which bind to various types of specific receptors and thus initiate complex signal transduction pathways. Due to the particular importance of receptors of the TNFR type for cutaneous wound healing, the aim of this thesis was to analyse the role of the Receptor Interacting Proteins in the regeneration and differentiation of the epidermal tissue. Initially, basal expression patterns of the rip genes in skin tissue and their regulation after wounding were analysed via Northern blot. Even though there was no obvious regulation of the moderately expressed genes of rip1, 2 and 5, a strong induction of rip3 gene expression was observed during the inflammatory stage of wound healing. Further analysis using the immunofluorescence technology could show that this was primarily due to increased expression in the granulation tissue. By contrast, the intense rip4-expression seen in intact skin was strongly downregulated early after wounding, particularly in the keratinocytes of the hyperproliferative epithelium. These results could be confirmed after scratch- wounding of keratinocytes in vitro. Furthermore, the patterns of rip gene expression were analysed in proliferating and differentiating keratinocytes in vitro. Whereas expression levels of the rip1, 3 and 5 genes were unaltered upon differentiation, rip2-expression was decreased in differentiating HaCaT- cells but not in differentiating primary keratinocytes. Upregulation of rip4 gene expression was associated with the early differentiation stage of both cell types, suggesting a role of RIP4 in keratinocyte differentiation. Based on these findings, the regulation of rip4 gene expression by different biological factors was studied in cultured keratinocytes in vitro. For this purpose, cells were treated with various growth factors and cytokines. Thus, we could show that a broad variety of factors such as whole serum, as well as EGF, TGF-β, Activin A, proinflammatory cytokines and reactive oxygen species lead to a repression of rip4 gene expression . Interestingly, this repression could be at least partially abolished by factors which act as inhibitors of the transcription factor NF-κB. Particularly, treatment with the glucocorticoid dexamethasone totally blocked the scratch-induced repression of rip4 gene, accompanied with an absence of reepithelialisation of the wounded keratinocytes, indicating a pivotal role of rip4 gene downregulation after wounding. To get further information about the precise function of RIP4 in epidermal keratinocytes, additional studies using specific siRNA were performed. Despite the fact that inhibition of rip4 gene expression had no effect on keratinocyte proliferation, a temporary induction especially of early markers of keratinocyte differentiation was observed in rip4-mRNA deficient cells, confirming the essential role of this protein in epidermal homeostasis. Finally, it could be demonstrated that activation of the transcription factor NF-κB is dependent on rip4 gene expression in keratinocytes. Since at the beginning of this study, nothing was known about the role of NF-κB in cutaneous wound healing, the activation patterns of this transcription factor in murine excisional wounds were determined: Thereby, we observed a strong NF-κB activation in certain cells of the granulation tissue, as well as in the keratinocytes of the hyperproliferative epithelium. Consistently, wounding of transgenic mice expressing a dominant negative inhibitor of NF-κB resulted in a distinct inflammatory phenotype, accompanied by a slightly delayed formation of the hyperproliferative epithelium. In addition, the restricted NF- κB activation in vivo led to constitutive expression of rip4 gene after wounding, as observed after dexamethasone application and wounding in vitro. In summary, it was shown that rip genes are differentially expressed in cutaneous wound repair and keratinocyte differentiation. Whereas most rip genes are only slightly expressed and not regulated in keratinocytes, it could be shown that RIP4 is an important modulator of epidermal regeneration upon wounding and a crucial regulator of keratinocyte differentiation.
