NMR studies of the yeast splicing factor Prp40: Structures and ligand recognition of a WW domain pair and an FF domain.

Abstract

Many eukaryotic proteins encompass multiple cooperating domains and/or domain repeats fine- tuning the functions of these so-called mosaic proteins. It is therefore of key interest to know not only the structures of the individual domains constituting a protein, but also their relative arrangement. The splicing factor Prp40 (pre-mRNA processing protein) comprises an N-terminal WW domain pair and six consecutive FF domains. In the yeast spliceosome, Prp40 is associated with the U1 snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) and interacts with a number of splicing factors functioning in cross-intron bridging.

In this Thesis, the solution structures of the tandem WW domains and the N-terminal FF domain of Prp40 have been determined by NMR (nuclear magnetic resonance) spectroscopy. To study the interaction of these Prp40 domains with the above-mentioned spliceosomal binding partners, 1H- 15N correlation spectra were recorded to map changes in the resonance frequencies of the domains upon ligand binding. It was found that the WW domains fold as triple-stranded anti- parallel beta- sheets, which are not in direct contact, but separated by a stable alpha-helical linker. Using 1H-155N residual dipolar couplings (RDCs) the relative orientation of the WW domains has been precisely defined despite the lack of inter-domain distance restraints, revealing that the binding pockets face opposite sides. This supports the idea that the two Prp40 WW domains function as central adaptors in early spliceosomal complexes, bringing two different binding partners together. This suggestion has been confirmed by a detailed analysis of the proline-rich motifs recognised by the Prp40 WW domains. Both Prp40 WW domains are shown to interact with PPxY motifs present in the splicing factors BBP and Prp8, but also with related peptides devoid of aromatic residues. However, no interaction was observed between the Prp40 WW domains and the CTD repeats used questioning the direct function suggested for the Prp40 WW domains in coordinating splicing and transcription.

The N-terminal FF domain of Prp40 exhibits a novel alpha-helical fold. The three-dimensional structure of the Prp40 FF1 domain consists of four tightly packed alpha-helices. The second alpha- helix and its surrounding residues are shown to constitute the binding surface, which can accommodate the N-terminal TPR motif of the spliceosomal protein Clf1. These findings further cement the role of Prp40 as a central adaptor unit in the early spliceosome. Given that lethal U1 snRNA mutations can be suppressed by a point mutation in the second Prp40 FF domain (FF2), a homology model of the FF2 domain has been generated based on the determined FF1 domain structure. This model reveals significant differences in the electrostatic surface potential of the FF domain binding sites. In contrast to the FF1 domain, the binding surface of the FF2 domain is highly positively charged suggesting that the Prp40 FF2 domain can directly bind the U1 snRNA, although its sequence does not display any known RNA recognition motif.

In summary, the data presented in this Thesis shed new light onto the structural arrangement of splicing factors present in the yeast pre- spliceosome. The described results suggest the formation of a tight complex between the U1 snRNP, Prp40, BBP, Prp8 and Clf1 in the early spliceosome, which brings the 5' and the 3' splice-site into spatial proximity.

Viele eukaryotische Proteine bestehen aus Domänen, deren Zusammenspiel die Funktion sogenannter Mosaikproteine oft entscheidend beeinflußt. Es ist daher von besonderem Interesse, nicht nur die Strukturen einzelner Proteindomänen zu kennen, sondern auch deren relative Anordnung. Der Spleißfaktor Prp40 (pre- mRNA processing protein) ist ein Mosaikprotein, das aus einem N-terminalen WW- Domänenpaar und sechs darauffolgenden FF-Domänen besteht. Im Hefe-Spleißosom bringt Prp40 die 3'-und 5'-Spleißstelle in räumliche Nähe. In dieser Arbeit wurden die Strukturen des WW-Domänenpaares und der N-terminalen FF- Domäne des Spleißfaktors Prp40 mittels NMR-Spektroskopie (Kernspinresonanz oder nuclear magnetic resonance) bestimmt. Mit Hilfe von 1H-15N Korrelationsspektren wurde außerdem die Wechselwirkung dieser Prp40-Domänen mit den obengenannten Spleißfaktoren anhand der Resonanzfrequenzänderungen der Domänen bei Zugabe von Liganden studiert. Es konnte gezeigt werden, daß die WW-Domänen sich zu drei-strängigen anti-parallelen beta-Faltblättern falten, die durch einen stabilen alpha-helikalen Linker räumlich voneinander getrennt sind. Die relative Domänenanordnung zeigt, daß die Bindungstaschen der WW-Domänen in entgegengesetzte Richtungen zeigen. Dieses Ergebnis bestätigt die Vermutung, daß die Prp40 WW-Domänen als zentrale Adapter im frühen Hefe-Spleißosom fungieren und zwei verschiedene Bindungspartner in räumliche Nähe bringen können. Weitere Hinweise, die diese Vermutung stützen, erhielt man aus einer detaillierten Analyse Prolin-reicher Motive, die an die WW-Domänen des Prp40-Proteins binden. Diese Analyse zeigte, daß beide WW-Domänen an die PPxY- Motive der Spleißfaktoren BBP und Prp8 binden. Außerdem wurden Wechselwirkungen zwischen den Prp40 WW-Domänen und verwandten Prolin-reichen Peptiden beobachtet, denen ein aromatischer Rest fehlte. Im Gegensatz dazu fand keine Wechselwirkung zwischen den Prp40 WW-Domänen und den verwendeten RNA Polymerase II CTD-Sequenzen statt, was an einer direkten Funktion der Prp40 WW-Domänen bei der Koordination von Transkription und Spleißen zweifeln läßt. Die N-terminale FF(FF1)-Domäne des Prp40-Proteins weist eine neuartige alpha-helikale Struktur auf. Die dreidimensionale Struktur besteht aus vier dicht gepackten alpha-Helices. Die zweite alpha- Helix bildet zusammen mit den umgebenden Seitenketten die Bindungsfläche für das N-terminale TPR-Motiv des Spleißfaktors Clf1. Diese Ergebnisse untermauern die Rolle von Prp40 als zentraler Bindungsplattform im frühen Spleißosom. Da bekannt ist, daß eine Punktmutation in der zweiten Prp40 FF-Domäne (FF2) letale U1 snRNA-Mutationen unterdrückt, wurde ausgehend von der bereits bestimmten Struktur der FF1-Domäne ein Homologiemodell der FF2-Domäne erstellt. Dieses Modell weist signifikante Unterschiede im elektrostatischen Oberflächenpotential der Bindungstellen dieser beiden FF-Domänen auf. Im Gegensatz zur FF1-Domäne ist die Bindungstelle der FF2-Domäne stark positiv geladen. Dies läßt vermuten, daß die FF2-Domäne direkt an U1 snRNA binden kann, obwohl ihre Aminosäuresequenz kein bisher bekanntes RNA-Erkennungsmotiv aufweist. Abschließend kann man sagen, daß diese Arbeit neue Einblicke in die strukturelle Anordnung von Spleißfaktoren im frühen Hefe-Spleißosom liefert. Anhand der hier präsentierten Ergebnisse läßt sich ein Modell vorschlagen, in dem das U1 snRNP mit den Spleißfaktoren Prp40, BBP, Prp8 und Clf1 ein dichtes Protein-RNA-Netzwerk bildet, das dazu dient, die 3'- und 5'-Spleißstelle in räumliche Nähe zu bringen.