Einfluß des Humanen-Herpesvirus 6 (HHV-6) auf die Humane Chimären-Hämatopoese im Xeno-Transplantatmodell der NOD/SCID Maus

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluß von HHV-6 auf die humane Hämatopoese in einem in vivo Modell untersucht. Zuerst wurden verschiedene sensitive und spezifische Nachweisverfahren für HHV-6 etabliert. Diese Nachweisverfahren beinhalteten den Nachweis von HHV-6 Proteinen mit monoklonalen Antikörpern, sowie HHV-6 DNA und HHV-6 RNA mit der PCR. Desweiteren wurde ein Echt-Zeit PCR Test zum quantitativen Nachweis von HHV-6 DNA etabliert. Die in dieser Arbeit entwickelten HHV-6 Nachweisverfahren wurden bereits in klinischen Studien evaluiert. Als Modell zur Untersuchung der humanen Hämatopoese wurde das Xenotransplantat-Modell der NOD/SCID Maus optimiert. Dazu mußte zuerst untersucht werden, ob HHV-6 pathogen für die NOD/SCID Maus ist. Nach Injektion von HHV-6 traten weder Veränderungen des Blutbildes, noch pathologische Veränderungen der Organe auf. Eine anhaltenden Infektion der Mäuse konnte weder auf der Basis des HHV-6 DNA Nachweises, noch des Antigen Nachweises beobachtet werden. Auch in vitro war eine Infektion muriner Zellen mit HHV-6 nicht möglich. HHV-6 repliziert dementsprechend nicht in Zellen der NOD/SCID Maus. Zur Untersuchung eines HHV-6 Einflusses auf die Chimären-Hämatopoese wurde das NOD/SCID Maus Modell bezüglich einer hohen Ausbeute humaner Zellen optimiert. Nach Transplantation von CB-MNC oder CB- CD34+ Zellen kam es zur Bildung einer humanen Multilinien-Hämatopoese in der NOD/SCID Maus. Die Supplementierung mit humanem IL-3 war bei Transplantation von CB-CD34+ Zellen mit zunehmendem Reinheitsgrad der Zellen essentieller und führte auch nach Transplantation von CB-MNC zu einer leicht erhöhten Bildung humaner Zellen und einer vermehrten Bildung myeloider Zellen gegenüber lymphoiden Vorläuferzellen. In einigen Versuchen konnten 80%-90% humane Zellen im Knochenmark der Mäuse detektiert werden. Mit Hilfe von LTBMC und Sekundär- Transplantationen konnte gezeigt werden, daß hIL-3 nicht nur zu einer erhöhten Proliferation der Zellen führt, sondern darüber hinaus das repopulierende Potential von PHSZ reduziert. PHSZ aus dem Knochenmark von Mäusen ohne hIL-3 Supplementierung hatten ein deutlich höheres repopulierendes Potential in sekundär-transplantierten Mäusen und LTBMC als hämatopoetische Stammzellen aus dem Knochenmark von Mäusen mit hIL-3 Supplementierung. Neben der Bildung humaner hämatopoetischer Zellen konnte nach Transplantation von hoch gereinigten CD34+ Zellen die Bildung humaner nicht-hämatopoetischer Zellen beobachtet werden. Offensichtlich enthält die Fraktion der CB-CD34+ Zellen auch Vorläuferzellen für Endothel- und Stromazellen. Die Produktion dieser Zellen wurde durch hIL-3 nicht beeinflußt. Die Infektion von CB-MNC mit HHV-6A resultierte in einer deutlich reduzierten Bildung humaner Zellen, unabhängig davon, ob die Zellen vor oder bereits nach der Transplantation infiziert wurden. Dabei war die Multilinien-Hämatopoese und die Bildung nicht- hämatopoetischer Zellen im Verhältnis zur Menge humaner Zellen nicht beeinträchtigt. HHV-6B hatte keinen Einfluß. Bei Infektion von CD34+ Zellen vor der Transplantation konnte keien reduzierte Bildung humaner Zellen beobachtet werden. Auch bei einer Infektion 3 Tage nach der Transplantation kam es zu keiner reduzierten Produktion humaner Zellen. Erst bei Infektion 12 Tage nach Transplantation zeigte sich der gleiche Effekt für HHV-6A, wie nach Transplantation von CB-MNC. HHV-6B hatte keinen Einfluß. Offensichtlich sind das "Homing" und die Bildung humaner Zellen aus CD34+ Zellen weder direkt noch indirekt durch HHV-6 beeinflußt. HHV-6A suszeptible Zellen müssen erst in der Maus gebildet werden. Bei Transplantation von CB-MNC werden diese bereits mit transplantiert. In einem in vitro Ansatz wurde der Einfluß von HHV-6 auf die Differenzierung von CD34+ Zellen zu Endothel- und Stromazellen gezeigt. Die HHV-6 Infektion führte zu einem schlechten Auswachsen der Kulturen und damit auch zu einer verminderten Bildung von Endothel- und Stromazellen. Ein spezifischer Effekt auf die Bildung dieser Zellen konnte nicht beobachtet werden. Mit zu diesem Zweck etablierten quantitativen RT-PCR Tests konnte HHV- 6B Infektion die reduzierte Transkription der KDR und vWF Gene gezeigt werden. HHV-6A hatte keinen Einfluß.

Herpesvirus infections are common in childhood and lead to latency in the host. During immunosuppression, for example bone marrow transplantation, reactivation of human herpesvirus 6 (HHV-6) may cause bone marrow failure and may consequently cause the death of the patient. In the present thesis an in vivo model of human hematopoiesis, the NOD/SCID mouse, was applied to investigate the influence of HHV-6 on the repopulation and differentiation potential of hematopoietic pluripotent stem cells. First, sensitive detection assays for HHV-6A and HHV-6B were developed. These assays include the detection of HHV-6 specific proteins using monoclonal antibodies and the amplification of HHV-6 DNA and RNA by PCR. Moreover, a quantitative real-time PCR assay was developed to determine HHV-6 DNA load. These assays were finally evaluated in clinical studies. To ensure the validity of the mouse model, it had to be demonstrated, that HHV-6 is not pathogenic for NOD/SCID mice. After infection of cell free HHV-6 or HHV-6 infected cord blood mononuclear cells (CB-MNC), no pathological changes or variation in the blood cell count could be observed when compared to control mice. Neither a persistent nor a latent infection could be shown by antigen or DNA detection. Finally, the infection of murine cells in vitro was ineffective. These data suggest, that HHV-6 does not replicate in murine cells and is therefore not pathogenic for NOD/SCID mice. The NOD/SCID mouse model was optimized to obtain maximal engraftment of human cells. The transplantation of CB-MNC or CB-CD34+ cells resulted in multi-lineage hematopoiesis in the mouse bone marrow, blood and organs. The supplementation of human IL-3 lead to increased engraftment and production of myeloid cells compared to lymphoid cells. IL-3 supplementation was essential after CD34+-cell transplantation. Under optimal conditions engraftment rates of up to 90% of human cells in mouse bone marrow could be obtained. Using long-term bone marrow cultures and repeated transplantations, it could be demonstrated that, in addition to the proliferative effect of IL-3, the repopulating potential of stem cells was reduced. In the absence of IL-3, the stem cells remained in a quiescent state and proliferation could only be induced by stimuli like secondary transplantation or cell passage. In addition to the production of hematopoietic cells, non-hematopoietic (NHC) cells could be detected in the bone marrow of CD34+-cell transplanted mice. Obviously, precursor NHC cells with stromal characteristics were present in the CD34+-cell fraction. The formation of NHC was not affected by IL-3 supplementation. Infection of CB-MNC with HHV-6A resulted in a reduced engraftment. This effect was observed even when infection was performed 12 days post-transplantation. The formation of a multi-lineage hematopoiesis remained unchanged, no single cell type was suppressed by the infection. This reduced engraftment was shown to be coupled to virus replication, since inactivated virus had no effect. However, HHV-6B had no effect on the engraftment. In CD34+-cell transplantation experiments, no effect could be observed with HHV-6A and HHV-6B when infection was performed before or on the first days after transplantation. Only when infection was done at day 12 post- transplantation, was an effect observed as with CB-MNC transplantation.. To investigate whether the formation of NHC can be influenced by HHV-6 in vitro, culture conditions were developed to differentiate CD34+-cells into NHC. The presence of HHV-6B lead to a decreased growth of NHC in general. Using quantitative real-time RT-PCR assays for endothelial cell-related genes, a reduced expression of the VEGF-2 receptor gene (KDR) and the von Willebrandt factor gene could be shown. HHV-6A had no effect in this setting. The results presented here lead to the following hypothesis: The homing and engraftment of CD34+-cells is not influenced by HHV-6. HHV-6A susceptible cells have to be generated in the mouse by differentiation. Those HHV-6 susceptible cells are already present in the CB-MNC cell population. In these cells HHV-6 can survive and replicate affecting stem cell proliferation.