Die Wirkung verschiedener Makrolid-Antibiotika im Vergleich zu Quinupristin/Dalfopristin auf Endothelzellen in vitro

Abstract

Im Rahmen dieser Dissertation wurden in vitro die Mechanismen der Entstehung einer Infusi- onsphlebitis untersucht. Dafür wurden die Oberflächenantigene CD 34, E-Selektin, ICAM-1 und VCAM-1 auf der Oberfläche von Endothelzellen analysiert. Weiterhin wurden in vitro die proinflammatorischen Potenziale des Streptogramins Quinupristin/Dalfopristin, der Makrolide Erythromycin und Clarithromycin sowie des Azalids Azithromycin bestimmt. Dafür wurden die zytotoxischen Wirkungen der Substanzen miteinander verglichen und die Ausprägung der proinflammatorischen Oberflächenantigene mit einer Immunmarkierung untersucht. Die Bestimmung und der Vergleich der zytotoxischen Potenziale der Infusionsformulierungen der untersuchten Substanzen geschah mit Hilfe eines modifizierten MTT-Zytotoxizitätstests zu- nächst mit Fibroblasten (BALB/C 3T3) und anschließend mit einer Endothelzelllinie (EA.hy 926). Weiterhin wurden mit dem gleichen Test auch die Reinsubstanzen von Erythromy- cin und Clarithromycin untersucht. Clarithromycin zeigte bei beiden Zellarten die höchste Zytotoxizität im untersuchten Konzentra- tionsbereich. Nur bis zu einer Konzentration von 10 mg/l konnte kein hemmender Effekt auf die Zellen nachgewiesen werden. Azithromycin zeigte ein nur wenig geringeres zytotoxisches Po- tenzial, wobei bei den Fibroblasten ein hemmender Effekt ab 50 mg/l und bei den Endothelzellen ab 10 mg/l ein hemmender Effekt gezeigt werden konnte. Erythromycin hingegen zeigte erst bei deutlich höheren Konzentrationen einen zytotoxischen Effekt auf die Zellen. Erst ab einer Kon- zentration von 200 mg/l zeigten sich konzentrationsabhängig zytotoxische Effekte in beiden Zellsystemen. Die Reinsubstanzen der Antibiotika wurden mit Methanol gelöst. Für Methanol konnte in dem verwendeten Konzentrationsbereich in Vorversuchen ein zytotoxischer Effekt nachgewiesen werden, der bei einem Vergleich der Ergebnisse zwischen den Infusionsformulierungen und den Reinsubstanzen berücksichtigt werden muss. Für Azithromycin zeigten sich ab 10 mg/l konzent- rationsabhängig zytotoxische Effekte. Bei Erythromycin konnten ab einer Konzentration von 200 mg/l hemmende Effekte nachgewiesen werden. Die beobachteten Unterschiede zwischen den zytotoxischen Effekten der Reinsubstanzen und den Infusionsformulierungen ist durch den Einfluss des Methanols als Lösungsmittler zu erklären. Die Ergebnisse aus dem MTT- Zytotoxizitätstest zeigen, dass die Konzentrationen die an der Infusionsstelle erreicht wer- den können, zytotoxische Wirkungen an den Zellen hervorrufen können. Dies muss als eine Ur- sache für die inflammatorischen Veränderungen der Vene bei intravenöser Gabe angesehen wer- den. Für eine detailliertere durchflusszytometrische Analyse der proinflammatorischen Oberflächen- antigene wurden Zellen der EA.hy 926 Endothelzelllinie verwendet. Dafür wurden die Zellen mit unterschiedlich hohen Konzentrationen der untersuchten Antibiotika für zwei Stunden inku- biert und nach einer expositionsfreien Zeit von 22 Stunden mit monoklonalen Antikörpern gegen die untersuchten Oberflächenantigene markiert. Die Behandlung der Zellen mit der Positivkontrolle Quinupristin/Dalfopristin führte mit steigen- der Konzentration zu den stärksten Zunahmen der als positiv markierten Zellen für alle vier un- tersuchten proinflammatorischen Epitope. In der höchsten untersuchten Konzentration von 800 mg/l zeigten sich auch bereits nach zwei Stunden Inkubation zytotoxische Effekte, die die Zellen zu einer geringeren Expression der Oberflächenantigene beeinflussten. Das Azalid Azithromycin erzeugte im Vergleich zu den untersuchten Makroliden die am stärks- ten ausgeprägten Reaktionen der Endothelzellen. Es konnten in einem Konzentrationsbereich von 200 mg/l bis 600 mg/l für alle untersuchten Epitope statistisch signifikante Zunahmen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollen gezeigt werden. Clarithromycin und Erythromycin zeig- ten ähnlich ausgeprägte Reaktionen auf den Endothelzellen. Diese waren aber weniger prägnant ausgeprägt als die durch Azithromycin induzierten Veränderungen. Während Clarithromycin in einem Bereich von 200 mg/l bis 600 mg/l eine konzentrationsabhängige Zunahme der Oberflä- chenantigene bewirkte waren mit Erythromycin zur Induktion einer vergleichbaren Reaktion Konzentrationen von 400 mg/l bis 1200 mg/l notwendig. Zum Vergleich wurde eine Inkubation der Endothelzellen mit TNF-α durchgeführt. Sie führte zu einer sehr deutlichen Zunahme von ICAM-1 auf den Zellen, während CD 34, E-Selektin und VCAM-1 anders als bei Quinupristin/Dalfopristin unter TNF-α unverändert blieben. Da die durchflusszytometrischen Experimente mit Endothelzellen einer Zelllinie durchgeführt wurden, wurden einzelne Konzentrationen der vier untersuchten Antibiotika auf ihre Reaktionen an einer Primärkultur von HUVECs untersucht. Es zeigte sich, dass die HUVECs deutlich weni- ger ausgeprägt auf die Antibiotika-Inkubation reagierten als die EA.hy 926 Endothelzellen. Für Clarithromycin und Erythromycin konnten jedoch statistisch signifikante Zunahmen der proinflammatorischen Oberflächenantigene im Vergleich zur nicht behandelten Kontrolle nach- gewiesen. Bei Azithromycin überwogen die zytotoxischen Effekte, so dass keine statistisch sig- nifikanten Unterschiede bei der Expression der Oberflächenmarker gezeigt werden konnten. Insgesamt zeigen die Ergebnisse der durchflusszytometrischen Bestimmung, dass alle untersuch- ten Antibiotika die Ausprägung verschiedener Adhäsionsmoleküle, die am Ablauf einer Inflam- mation beteiligt sind, konzentrationsabhängig verändern. Die Rangfolge der Ausprägung solcher Veränderungen spiegelt die Reihenfolge der Inzidenzen von infusionsbedingten Phlebitiden der Substanzen der therapeutischen Verwendung wieder.

An inflammatory reaction at the site of infusion is a common clinical problem that is observed after the intravenous application of antibiotics and other drugs. The pathomechanism of this infusion-related phlebitis is not fully understood. We analyzed the effects of the three macrolide antibiotics erythromycin, clarithromycin and azithromycin on human endothelial cells in vitro. As a positive control quinupristin/dalfopristin was studied. The cytotoxicity of all substances was analyzed by a modified MTT cytotoxicity assay with 3T3-fibroblasts and EA.hy 926 endothelial cells. Cells were incubated for ten days with the antibiotics. After adding MTT the optical density was measured which correlates with cell death. Clarithromycin exhibited the strongest cytotoxic effect on EA.hy 926 cells (EC50 30 mg/L), followed by azithromycin (EC50 40 mg/L), a cytotoxic effect of erythromycin could only be observed at much higher concentrations (EC50 310 mg/L). The reaction of the endothelial cells was further analyzed in detail by means of flow cytometry. For these experiments the endothelial cell line EA.hy 926 as well as primary cells (HUVEC) were used. The antigens were stained with fluoresceinisothiocyanat- or phycoerythrin-conjugated monoclonal antibodies for the following surface antigens: CD34, E-selectin (CD62E), ICAM-1 (CD54) and VCAM-1 (CD106). Cells were incubated with the antibiotics at concentrations ranging from 100 mg/L to 800 mg/L (clarithromycin and azithromycin) and from 200 mg/L to 1200 mg/L (erythromycin). These concentrations occur under therapeutic conditions at the site of infusion. Cells were incubated for 2 h and analysis was carried out after an additional culture period of 22 h without test compounds. A significantly enhanced expression of all four antigens was observed which was most pronounced at 800 mg/L (erythromycin), 600 mg/L (azithromycin) and 400 mg/L (clarithromycin). A concentration of 800 mg/L erythromycin medium caused an increase of the expression of CD34 (+6%), E selectin (+5%), ICAM-1 (+14%) and VCAM-1 (+5%). At lower concentrations (600 mg/L) azithromycin provokes a stronger upregulation of the proinflammatory antigens: CD34 (+17%), E-selectin (+18%), ICAM-1 (+27%) and VCAM-1 (+17%). At a concentration of 400 mg/L medium clarithromycin induced a similar effect as erythromycin at twice this concentration CD34 (+5%), E-selectin (+7%), ICAM-1 (+23%) and VCAM-1 (+4%). Reactions of the HUVECs were less pronounced than those of the EA.hy 926 cells. Cell surface markers involved in interactions between endothelial cells and leukocytes proved to be useful markers to study differences in the proinflammatory potential of the three macrolides. By analysing the upregulation of these antigens on EA.hy 926 cells in vitro the risk of phlebitis could be predictable for other drugs as well.