Methylierungsanalyse des Neurofibromatose Typ 1-Promotors in Neurofibromatose Typ 1-assoziierten Tumoren

Abstract

Multiple periphere Nervenscheidentumore zählen zu den Hauptsymptomen der Neurofibromatose Typ 1 (NF1). Die benignen peripheren Nervenscheidentumore können in dermale und plexiforme Neurofibrome eingeteilt werden. Während dermale Neurofibrome umschrieben sind, können letztere das umliegende Gewebe diffus infiltrieren und besitzen das Potential zur Progression zum malignen peripheren Nervenscheidentumor (MPNST). Zielstellung der vorliegenden Arbeit war die Methylierungsanalyse des NF1-Promotors in NF1-assoziierten Tumoren. Dazu wurde das Methylierungsmuster des NF1-Promotors in 9 dermalen Neurofibromen, 7 plexiformen Neurofibromen und 5 MPNST von NF1-Patienten mittels genomischer Bisulfitsequenzierung untersucht. Zum Vergleich wurden Leukozyten von 20 Kontrollprobanden herangezogen. Die analysierte Region repräsentiert den Hauptteil der NF1-CpG-Insel und umfasst den Promotor, 5 UTR, Exon1 und einen Teil vom Intron 1. Die gesamte Basensequenz von Position -286 bis +650 wurde auf Methylierung der Cytosinreste überprüft. In den 21 analysierten NF1-assoziierten Tumoren wurde keine globale Hypermethylierung im NF1-Promotor detektiert. Die methylierungsvermittelte Inaktivierung des NF1-Gens scheint somit kein häufiger Mechanismus in der NF1-Tumorigenese zu sein. Stattdessen könnte die geringgradige (Median 1,35 %) und zufällig verteilte Methylierung der Cytosinreste in der untersuchten Region eine globale Hypomethylierung widerspiegeln, wie sie häufig in Neoplasien beobachtet wird. Vor dem Hintergrund der geringgradigen Methylierung zeigten 24 individuelle Positionen in 10 von 21 Nervenscheidentumoren deutliche Methylierungsspitzen. Fünf der site-specific methylierten Positionen liegen in vermutlichen Transkriptionsbindungsstellen für das cAMP response element (CRE) (-10) und AP-2 (+77, +343, +466, +472). Die Methylierungssensitivität der NF1-Sequenz für CRE (-16) bindende Proteine wurde bereits in vitro gezeigt. Unsere Daten demonstrieren zum ersten Mal die in vivo Methylierung des -16 CRE Motivs an Position -10 in einem plexiformen Neurofibrom und einem MPNST. Da hohe Dosen von cAMP die NF1-Genexpression induzieren, scheint die Methylierung dieser Bindungsstelle eine regulatorische Rolle in der NF1-Tumorigenese zu spielen. Die Region von Position +336 bis +370/71, die eine mutmaßliche AP-2 Bindungsstelle enthält, in den Leukozyten von 4 der 20 Kontrollprobanden bzw. von einem NF1-Patienten methyliert vor. AP-2 Bindungsstellen sind methylierungssensitiv und in die Genregulation involviert. Die Methylierung dieses spezifischen AP-2 Motivs könnte daher die NF1-Promotoraktivität beeinflussen. In unserer Studie war ein Teil der NF1-Methylierung in Tumoren und Leukozyten der non-CpG -Methylierung zuzuschreiben. Obgleich in eukaryontischen Zellen CpG-Dinukleotide als primäres Ziel der DNA-Methylasen bekannt sind, konnte auch die Existenz von non-CpG -Methylierung nachgewiesen werden. Die CpG-Methylierung war signifikant höher als die non-CpG -Methylierung in Neurofibromen und Leukozyten, nicht jedoch in MPNST. Diese Beobachtung könnte widerspiegeln, dass im Gewebe ein spezifisches Muster an CpG-Methylierung besteht, das im Prozess der genomischen Hypomethylierung in malignen Tumoren verschwindet.

Multiple peripheral nerve sheath tumours are among the principal symptoms of neurofibromatosis type 1 (NF1). Benign peripheral nerve sheath tumours can be divided into dermal and plexiform neurofibroma. Whereas dermal neurofibromas are defined, the later can diffusely infiltrate the surrounding tissue and have the potential to progress to malignant peripheral nerve sheath tumours (MPNST). The aim of this study was to analyse the methylation of the NF1 promoter in NF1-associated tumours. In order to do this the methylation pattern of the NF1 promoter in 9 dermal neurofibromas, 7 plexiform neurofibromas and 5 MPNSTs of NF1 patients were studied by means of genomic bisulphate sequencing. As a comparison leukocytes from 20 control test subjects were used. The analysed region represents the major part of the NF1-CpG island and includes the promoter, 5 UTR, Exon1 and a part of the Intron 1. The entire base sequence from position -286 to +650 was examined for methylation of the cystosine residues. In the 21 analysed NF1-associated tumours no global hypermethylation in the NF1 promoter was detected. The methylation-mediated inactivation of the NF1 gene does not therefore appear to be a frequent mechanism in NF1 tumourigenesis. Instead, the low-level (median 1.35%) and arbitrarily distributed distribution of the cytosine residues in the examined region could reflect global hypermethylation as is frequently observed in neoplasias. Against the background of low-level methylation 24 individual positions in 10 out of 21 nerve sheath tumours exhibited clear methylation peaks. Five of the site-specific methylated positions are in presumed transcription binding points for the cAMP response element (CRE) (-10) and AP-2 (+77, +343, +466, +472). The methylation sensitivity of the NF1 sequence for CRE (-16) binding proteins has already been demonstrated in vitro. Our data show for the first time the in vivo methylation of the -16 CRE motifs at position -10 in a plexiform neurofibroma and an MPNST. As high doses of cAMP induce NF1 gene expression the methylation of this binding position appears to play a regulatory role in NF1 tumourigenesis. The range from position +336 to +370/71, which contains a presumed AP-2 binding point, appears to be methylated in the leukocytes of 4 out of 20 control subjects. AP-2 binding points are sensitive to methylation and are involved in gene regulation. The methylation of this specific AP-2 motif could therefore influence NF1 promoter activity. In our study part of the NF1 promotor methylation in tumours and leukocytes was ascribed to non-CpG methylation. Even though in eucaryontic cells CpG-dinucleotides are known as the primary target of DNA methylases, the existence of non-CpG methylation could also be demonstrated. CpG methylation was significantly greater than non-CpG methylation in neurofibromas and leukocytes, but not in MPNST. This observation could reflect the fact that in the tissue a specific CpG methylation exists that disappears during the process of genomic hypomethylation in malignant tumours.