Effect of painful inflammation on proopiomelanocortin gene expression and β-endorphin production in lymphocytes

Abstract

POMC is the precursor of different biologically active peptides like ACTH and END and is produced in the pituitary and in non-pituitary tissues such as immune cells. END is released from immune cells migrating into inflamed tissue which can attenuate inflammatory pain by activating opioid receptors on peripheral terminals of sensory neurons. While all biologically active POMC- derived peptides such as END are encoded by exon 3, the signal peptide required for the entry of the nascent polypeptide into the regulated secretory pathway, is encoded by exon 2 of the POMC gene. However, the expression of signal sequence-encoding POMC mRNA in lymphocytes has long been a matter of debate which is related to the predominant expression of 5`-end truncated transcripts that do not encode the signal sequence. Hypothesizing that the transcription of such POMC mRNA is enhanced in lymphocytes under pathological situations the present study investigated POMC mRNA expression and END levels in the draining LN during the development of a local painful paw inflammation in rats. Using RT- and RACE-PCR several POMC mRNA molecules were identified. Besides detection of low levels of full-length POMC mRNA comprising exons 1, 2, and 3, various 5`-end truncated transcripts were expressed in lymphocytes. In accordance with previous studies none of these truncated POMC mRNAs encoded the signal sequence. While levels of truncated POMC mRNA remained unchanged, qRT-PCR analysis showed that exon 2-3 spanning POMC mRNA levels increased in lymphocytes 2 h after induction of paw inflammation. In the pituitary, the expression level of exon 2-3 spanning POMC transcripts was unaltered, indicating that POMC gene expression was not systemically enhanced. Immunofluorescence showed co-localization of POMC and END in LN cells and flow cytometry analysis showed that opioid peptides were expressed in T helper and cytotoxic T-cells, in B-cells and in monocytes/macrophages. By cell separation signal sequence-encoding POMC transcripts were identified in both T- and B-cells. The mRNAs of the POMC processing enzymes PC1/3 cleaving POMC into ACTH and beta-LPH and PC2 that converts beta-LPH into END were differentially expressed in T- and B-cells. T lymphocytes expressed only PC2 while the expression of both prohormone convertases was induced in B-cells after induction of paw inflammation. Radioimmunoassay analysis revealed that the amount of END increased more than 2-fold on a cellular base within the first 12 - 24 h of inflammation. Together these findings indicate that newly synthesized lymphocytic END can be attributed to an enhanced transcription of signal sequence-encoding POMC mRNA during inflammation. This provides an important missing link in the demonstration of a classical processing of POMC into biologically active peptides in immune cells. In accordance with findings in pituitary cells, signal sequence-encoding POMC mRNA seems to be translated and processed into END within 6 - 12 h in lymphocytes.

POMC ist der Precursor verschiedener biologisch aktiver Peptide wie ACTH und END. Neben der Hypophyse produzieren auch nicht-hypophysäre Gewebe wie Immunzellen POMC und die davon abgeleiteten Peptide. Immunzellen setzen END beispielsweise in entzündetem Gewebe frei und durch die Bindung dieses Opioids an Opioidrezeptoren auf peripheren Nervenendigungen kann Entzündungsschmerz vermindert werden. Während alle Sequenzen der biologisch aktiven Peptide auf dem dritten Exon des POMC-Gens kodiert sind, befindet sich die Sequenz zur Translation des Signalpeptids, welches für den Eintritt des Vorläufermoleküls in den sekretorischen Weg unverzichtbar ist, auf dem zweiten Exon. In Lymphozyten wird die Expression von Signalsequenz-kodierender POMC mRNA seit längerem kontrovers diskutiert, da diese Immunzellen vorwiegend am 5`-Ende verkürzte Moleküle ohne Signalsequenz exprimieren. Unter der Annahme, dass die Transkription Signalsequenz-kodierender POMC mRNA unter pathologischen Bedingungen in Lymphozyten induziert wird, untersuchte die vorliegende Studie die Expression von POMC mRNA und den END-Gehalt im drainierenden Lymphknoten im Verlauf einer schmerzhaften, lokalen Pfotenentzündung an Ratten. Mittels RT- und RACE-PCR konnten eine Vielzahl an verschiedenen POMC mRNA-Molekülen identifiziert werden, darunter das schwer detektierbare, Exon 1, 2 und 3 einschließende Full-length POMC und diverse am 5`-Ende verkürzte Moleküle. In Übereinstimmung mit anderen Studien wiesen die verkürzten POMC mRNAs keine Signalsequenz auf. Die Quantifizierung von Exon 2-3 überspannenden POMC mRNA Transkripten mittels qRT-PCR zeigte, dass diese nach 2 Stunden Entzündungszeit um ein Vielfaches hochreguliert wurde, dagegen zeigten sich bei verkürzter POMC mRNA keine Expressionsunterschiede. Da das Expressionsniveau von Exon 2-3 überspannender POMC mRNA nach Induktion der Pfotenentzündung in der Hypophyse unverändert blieb, scheint kein systemischer Effekt an der Erhöhung dieser POMC mRNA in den Lymphozyten beteiligt zu sein. Die Analyse von Lymphknoten mittels Immunfluoreszenz zeigte, dass POMC und END in Lymphknotenzellen co- lokalisiert sind und mittels Durchflusszytometrie und Immunohistochemie konnten Opioidpeptide wie END in T-Helferzellen, in zytotoxischen T-Zellen, in B-Zellen und Monozyten/Makrophagen identifiziert werden. Entsprechend konnte die Expression von Signalsequenz-kodierender POMC mRNA in T- und B-Zellfraktionen separierter Lymphknoten gezeigt werden. T-Lymphozyten exprimierten zudem die mRNA des POMC Prozessierungsenzyms PC2, das für die Konvertierung von beta-LPH in END zuständig ist. In B-Zellen war die Expression von PC2 erst nach Induktion der Entzündung detektierbar. Die Prohormonkonvertase PC1/3, die POMC in ACTH und beta-LPH konvertiert, war ausschließlich in B-Zellen entzündeter Lymphknoten nachweisbar. Die kinetische Peptidanalyse ergab, dass sich der zelluläre END-Gehalt von Lymphozyten innerhalb von 12 - 24 h Entzündungsdauer mehr als verdoppelte. Diese Befunde deuten darauf hin, dass die Neusynthese von END im Entzündungsverlauf auf eine verstärkte Transkription von Signalsequenz-kodierender POMC mRNA zurückgeführt werden kann. Diese Ergebnisse erbringen zudem den Nachweis eines wichtigen fehlenden Bindegliedes bei der Demonstration der klassischen Prozessierung von POMC in biologisch aktive und sezernierbare Peptide in Immunzellen. Im Einklang mit ähnlichen Befunden aus der Hypophyse scheinen in Lymphozyten zwischen erhöhter Transkription und Peptidanstieg unter Entzündungsbedingungen etwa 6 - 12 Stunden zu vergehen.