Metabolische Rolle des Enzyms Pyruvat, Phosphat Dikinase in transgenen Tabakpflanzen

Abstract

In Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedenen PPDK-überexprimierende Tabaklinien untersucht. Die PPDK wurde entweder unter der Kontrolle des 35S- Promotors bzw. des wurzelspezifischer B33-Promotors im Cytosol oder alternativ in den Plastiden überexprimiert (Sheriff, 1994; Stenzel, 1997). In ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss unterschiedener Stickstoffquelle auf das Wachstum und Produktivität der transgenen Tabaklinien und des Wildtyps untersucht. Stickstoff wurde als eine Kombination von Nitrat und Ammonium (20% des gesamten Stickstoffs als Ammonium); Nitrat (einzige N-Form) oder Ammonium (einzige N-Form) gegeben. Außerdem wurde eine N-defizitäre Lösung (3 mM NO3-) als Kontrolle genommen. Die Mutanten zeigten im Vergleich zum Wildtyp ein signifikant höheres Wachstum bei Stickstoffangebot und eine Reduktion des Wachstums. Die transgenen Pflanzen zeigten eine erhöhte Toleranz für Ammonium als einzige Stickstoffquelle. Der Samenertrag war in den transgenen Tabakpflanzen höher als beim Wildtyp. Es ist anzunehmen, dass die Steigerung von Wachstum und Samenertrag in den PPDK-Transformanden durch eine verbesserte Bereitstellung von C-Skeletten für die Aminosäuresynthese bewirkt wird. Die reversible PPDK-Reaktion wird in den Plastiden durch die hohe Pyrophosphatase- Aktivität in Richtung Phosphoenolpyruvat (PEP) gezogen. PEP dient als Substrat zur Bildung von Oxalacetat (OAA) durch die PEP-Carboxylase. OAA kann in einer anaplerotischen Reaktion den Zitrat-Zyklus auffüllen oder direkt zu Malat reduziert werden. Die Ergebnisse der die PPDK im Cytosol überexprimierenden Linien zeigten, dass die PPDK-Reaktion im Cytosol auch in die Richtung der PEP-Synthese läuft. In zweiten Teil der Arbeit wurde die Al-Toleranz der transgenen Tabakpflanzen in Vergleich zum Wildtyp untersucht. Die Daten deuten darauf hin, dass die Aluminium-Toleranz der Transformanden durch erhöhte Abgabe von organischen Säuren aus der Wurzel verursacht wird. Diese bilden einen Komplex mit dem Metallkation und vermindern so die Aufnahme in die Wurzel. Die PPDK erhöht die Säureextrusion durch die Bereitstellung von Phosphoenolpyruvat (PEP), das durch PEP-Carboxylase katalysierte Carboxylierung Oxalacetat als Vorstufe der organischen Säuren liefert. Unsere Ergebnisse lassen darauf schließen, dass beim Wildtyp zumindest unter Aluminium-Stress ein Engpass bei der Bereitstellung von PEP besteht, der in den PPDK-Transformanden verringert oder aufgehoben wird. Da die Transformation mit PPDK ansonsten keinen nachteiligen Phänotyp verursacht, sondern im Gegenteil noch Wachstum und Samenertrag bei Stickstoffdüngung verbessert, scheint sie eine gute Möglichkeit darzustellen, die Aluminium-Toleranz von Pflanzen zu verbessern.

Transgenic tobacco plants overexpressing the M. crystallinum PPDK gene were studied. Four different construct were generated, using two different promoters (CaMV-35S and B33) and two different cDNA sequences (one directed to plastids, the other to the cytosol) (Sheriff, 1994; Stenzel, 1997). The effect of nitrogen on the behaviour of transgenic and wild type tobacco plants was tested during the first experiments. Treatments included a combination of nitrate and ammonium (20% of the total nitrogen as ammonium); nitrate (as only N-form supplied) and ammonium (as the only N-form supplied). Control plants received a solution low in N (3 mM NO3-). The mutants showed a significant higher growth when grown in nitrogen, whereas at low N supply their growth was reduced in comparison to the wild-type. Transgenic plants showed stronger tolerance to ammonium in comparison to the wild-type. Seed yield in transgenic plants was higher in comparison to the wild-type. This suggests that the increase in growth and seed production in transgenic plants may be the result of a better supply of C-chains for the formation of amino acids. In the plastids the reversible PPDK-reaction is shifted in direction to phosphoenolpyruvate (PEP) because of the high pyrophosphatase-activity. PEP serves as substrate for the formation of oxalacetate (OAA) by the PEP- carboxylase. OAA can be incorporated into the citric acid cycle or directly reduced to malate. The results observed on transgenic lines showed that the PPDK-reaction in the cytosol leads to PEP-synthesis. Transgenic tobacco plants and the wild-type where further analyzed to elucidate their growth response in the presence of Aluminium (Al). The data indicates that Al tolerance observed in transgenic plants was increased via exudation of organic acids in the roots. Organic acids complex the Al, avoiding it uptake by roots. In wild-type plants, at least under Al stress conditions, supply of PEP may be more difficult. As overexpression of PPDK causes no visible phenotypical changes, but improves productivity and growth under a good nitrogen supply, PPDK may represent a possibility to increase tolerance to Al stress in plants.