Experimente zur Optimierung der Methodik der zweidimensionalen Gelelektrophorese (2D-Gelelektrophorese)

Abstract

Die hier vorliegende Dissertation bearbeitet folgende zwei Problembereiche der Methodik der 2D-Gelelektophrese: a) Darstellung transmembraner Proteine (TMP): Ziel dieses Projektes war es, möglichst viele TMP aus Synaptosomen des Rattenkortex auf 2D-Gelen darzustellen. Zur Anreicherung hydrophober Proteine wurden die Synaptosomen zusätzlich mit 7 M Urea oder mit Na2CO3 gewaschen. Die Proteinextrakte wurden auf 2D-Gele mit den pH-Bereichen 4-7 und 6-11 geladen. Von den 492 durch MALDI-MS/MS identifizierten Proteinen besaßen nur zwei jeweils eine transmembrane Domäne. Weitere Experimente zur Abklärung des Verbleibs der TMP zeigten, dass diese Proteine in der Geloberkante des 2D-Gels „stecken geblieben" waren: dort konnten durch LC-MS/MS 34 nicht fokussierte TMP mit bis zu 12 transmembranen Helices identifiziert werden. Dieser Befund weist darauf hin, dass die TMP - vermutlich aufgrund „hydrophober Wechselwirkungen" \- nach Extraktion und Denaturierung hochmolekulare Aggregate bilden. Diese Aggregate quellen in die IPG-Streifen der 1. Dimension ein, fokussieren dort aber nicht. Sie werden dann auf das 2D-Gel transferiert, wo sie jedoch aufgrund ihrer Größe an der Geloberkante „hängen bleiben". Zusätzliche Experimente mit der Methodik der 1D-Gelelektrophorese zeigten, dass sich diese Aggregate weder durch Erhitzen noch durch Vorbehandlung mit organischen Lösungen, Säuren oder kationischen Detergenzien auflösen lassen. b) Quantitative Vergleichbarkeit: Ziel des zweiten Teils dieser Dissertation war es, herauszufinden, welcher Prozentsatz an Proteinspots zwischen zwei Gruppen von 2D-Gelen im pH-Bereich 4-7 signifikant unterschieden werden können, wenn diese mit verschiedenen Proteinmengen beladen sind („Power- Analyse"). Anfängliche Experimente mit zwei Gelgruppen von je sechs Gelen, beladen mit jeweils 200 µg bzw. 250 µg, zeigten unzureichende Ergebnisse: Von den 546 gematchten Spots zeigten nur 130 Spots (23,8%) eine signifikante Veränderung (p<0,05) in der Spotintensität. Davon waren 72 Spots aus der 250µg-Gruppe signifikant erhöht, 58 Spots dieser Gruppe waren jedoch signifikant niedriger als in der 200µg-Gruppe. Die Konstruktion neuer Apparaturen zur gleichzeitigen Verarbeitung von 24 Gelen während aller Einzelschritte der Prozedur der 2D-Gelelektrophorese sowie die Eliminierung verschiedener, für die hohen Intergelvarianzen verantwortlichen Faktoren verbesserten die Ergebnisse erheblich. Es gelang, signifikante Unterschiede in den Spotintensitäten bei 77%-90% aller gematchten Spots nachzuweisen, wenn Gelgruppen mit einem Unterschied in der Proteinlademenge von 25% verglichen wurden. Bei 50%igen Unterschieden in der Proteinlademenge konnten über 90% der gemachten Spots signifikant unterschieden werden. Damit ist es erstmals möglich, mit der Methodik der 2D-Gelelektrophorese Unterschiede der Intensitäten von Proteinspots zwischen zwei Stichproben von nur 25% zuverlässig statistisch zu erfassen.

This dissertation processed the following two major problems of the method of 2D-gelelectrophoresis: a) Visualisation of transmembrane proteins (TMPs): The aim of this first part of this dissertation was to visualise as much as possible TMPs out of membrane-enriched synaptosomes from rat frontal cortex on 2D-gels. To enrich TMPs the synaptosomes were washed with 7 M urea or Na2CO3. 200 µg protein from each preparation was loaded on 2D-gels covering the pH 4-7 and 6-11 range, respectively. MALDI-MS/MS analysis detected only 2 TMPs among 492 analysed spots. Further experiments showed, a strongly ruthenium stained, unfocused horizontal smear at the upper edges of the gels. LC/MS/MS analysis revealed that this smear contained numerous, unfocused TMPs with up to 12 transmembrane helices. This indicates that after extraction and denaturation the TMPs may form high-molecular aggregates, due to their "hydrophobic interactions". These aggregates enter the IPG strips, but do not focus regularly. They are then transferred onto the 2D-Gels, where they remain caught at the upper edge. Additional experiments with the method of 1D- gelelectrophoresis showed that these aggregates neither soluble by heating, organic solvents, acids nor cationic detergents. b) Quantitative comparability: The purpose of the second part of this dissertation was to test the extent to which differences in spot intensity can be reliably recognized between two groups of 2D-gels covering the pH 4-7 range each loaded with different amounts of protein from rat brain (power analysis). Initial experiments yielded only unsatisfactory results: 546 spots were matched from two groups of 6 gels each loaded with 200µg and 250µg protein, respectively. Only 130 spots (23,8%) showed a significant alteration (p<0,05). Thereof only 72 spots were higher, while 58 spots were significantly lower in the 250µg- group. The construction of new apparatuses that allowed the simultaneous processing of 24 gels throughout all steps of the procedure of the 2D- gelelectrophoresis considerably lowered the between-gel variation. This resulted in the detection of significant differences in spot intensities in 77-90% of all matched spots on gel groups with a 25% difference n protein load. At a difference of 50% in protein load, more than 90% of all spots differed significantly between two experimental groups.