Genregulation im Endothelin- und Renin-Angiotensin-System: \--------

Abstract

Die Untersuchung von genregulatorischen Mechanismen im Endothelin- und Renin- Angiotensin-System stellt den Fokus dieser Habilitationsschrift dar, wobei (a) Protein-DNA-Interaktionen auf Promotorebene sowie Beeinflussung dieser durch Signaltransduktionswege, (b) Promotorpolymorphismen und (c) epigenetische Aspekte analysiert wurden. Wir konnten den Promotor des humanen Prionenproteins sowie drei isoformspezifische Promotoren des humanen Endothelin-Konvertierungsenzyms-1 (ECE-1) klonieren und funktionell - beispielsweise bezüglich transkriptioneller Startpunkte und cis-Elementen -charakterisieren. Dabei konnte unter anderem demonstriert werden, dass der im Rahmen der Herzentwicklung essentielle Transkriptionsfaktor Nkx2-5 die ECE- 1a-, -1b-und -1c-Isoformen positiv reguliert, wobei Protein-DNA-Interaktionen, Promotoraktivitäten und die mRNA-Ebene analysiert wurden. Damit konnten wir erstmalig eine direkte molekulare Verbindung zwischen dem Endothelinsystem und Nkx2-5 aufzeigen, welcher eine wahrscheinliche Bedeutung in der Pathogenese angeborener Herzfehler zukommt. Bezüglich des ECE-1b-Promotors konnten wir zwei single nucleotide polymorphisms (SNPs) identifizieren und beim Menschen die signifikante Assoziation dieser mit essentieller arterieller Hypertonie aufzeigen. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass einer dieser Polymorphismen die Bindungsaffinität und die Transaktivierungsaktivität des Transkriptionsfaktors E2F-2 verändert, womit erstmalig eine Verbindung zwischen essentieller Hypertonie und Zellzyklusregulation demonstriert werden konnte. Im humanen ECE-1c-Promotor wurde unter anderem der Methylierungsstatus sowie der funktionelle Effekt einer in vitro-Methylierung analysiert. Weiterhin konnte die ausgeprägte funktionelle Relevanz eines [CpG]m-[CA]n-Mikrosatellitenpolymorphismus nachgewiesen werden. Bezüglich des Renin-Angiotensin-Systems (RAS) konnte das zuvor unbekannte Protein ATBP (AT2R binding protein) durch uns kloniert werden, welches an den zytoplasmatischen Bereich des Angiotensin-AT2-Rezeptors (AT2R) bindet und antiproliferative Eigenschaften dieses Rezeptors vermittelt. Kürzlich konnten wir als erste Arbeitsgruppe die Signaltransduktion des Renin-/ Prorenin-Rezeptors (RER) basierend auf Protein-Protein- und Protein-DNA-Interaktionen aufschlüsseln und nachweisen, dass der Transkriptionsfaktor PLZF ein direktes Adapterprotein des RER darstellt, nach Rezeptoraktivierung in den Zellkern transloziert und dort zielgenabhängig als Aktivator aber auch Repressor fungieren kann. Schließlich konnten wir eine neue Formel - die sog. GED (Gene Expression’s CT Difference)-Formel - zur Auswertung von real-time PCR-Daten mathematisch herleiten und experimentell validieren.

Analysis of gene regulatory mechanisms within the endothelin and renin- angiotensin system represents the focus of this habilitation. These mechanisms can be grouped into (a) signal transduction pathways and their downstream protein-DNA interactions on the promoter level, (b) promoter polymorphisms and (c) epigenetic aspects. Our group was able to clone and functionally characterise - e.g. regarding transcriptional start sites and cis-elements - the promoter of the human prion protein as well as three isoform-specific promoters of the human endothelin-converting enzyme-1 (ECE-1) gene. We could establish the first molecular link between the transcription factor Nkx2-5, which is essential for cardiac development, and the endothelin system, an interaction which is likely involved in the pathogenesis of congenital heart defects. Furthermore, two single nucleotide polymorphisms (SNPs) were identified in the human ECE-1b promoter region which could be associated with human arterial hypertension. In addition, we were able to demonstrate that one of these SNPs alters the affinity for and the transactivation potential of the transcription factor E2F-2, thereby linking essential hypertension and cell cylce regulation. In the human ECE-1c promoter the basal methylation status and functional effects of an in vitro methylation were analysed. Additionally, the strong regulatory impact of a polymorphic [CpG]m-[CA]n microsatellite repeat within the human ECE-1c promoter was revealed. Regarding the renin- angiotensin system (RAS) a previously unknown adapter protein of the angiotensin AT2 receptor (AT2R), named ATBP (AT2R binding protein), was discovered mediating for example the antiproliferative effects of this receptor. Recently, our group deciphered the signal transduction cascade of the renin/ prorenin receptor (RER) in which the transcription factor PLZF acts as a direct adapter protein of the RER. Finally, a novel formula, called GED (Gene Expression’s CT Difference), for the analysis of real-time PCR data was mathematically derived and experimentally validated.