Untersuchungen zur anti-apoptotischen Wirkung des Proteasomaktivators PA28gamma

Abstract

Die bisher identifizierten Zielproteine des nukleären Proteasomaktivators PA28gamma weisen darauf hin, dass dieser an der Regulation wichtiger zellulärer Prozesse wie der Zellproliferation, der DNA-Reparatur und der Tumorentstehung beteiligt ist. Es konnte auch gezeigt werden, dass PA28gamma ein negativer Regulator der Apoptose sein kann, wobei die zugrundeliegenden Mechanismen noch wenig untersucht sind. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, den Einfluss von PA28gamma auf wichtige apoptotische Ereignisse zu untersuchen. Dafür wurden in vitro-Experimente mit Zelllinien durchgeführt, bei denen die PA28gamma-Expression durch exogene DNA verstärkt bzw. durch miRNA-vermittelten Knockdown verringert war. Die Ergebnisse bestätigen PA28gamma als einen anti-apoptotischen Regulator und zeigen, dass PA28gamma verschiedene apoptotische Ereignisse beeinflusst. Im Besonderen führt PA28gamma unter apoptotischen Bedingungen zur Akkumulation von Cytochrom c im Mitochondrium, zur Inhibierung der Caspaseaktivität, zur Phosphorylierung von nukleärem p53 und letztendlich zu einer verringerten Apoptose. Die in dieser Arbeit gewonnen Daten und die daraus resultierenden Hypothesen legen die Grundlage für weitere detaillierte Untersuchungen der anti-apoptotischen Funktion von PA28gamma. Verschiedene Tumorarten können mit erhöhten PA28gamma- Level assoziiert sein. Aber auch bei systemischen Autoimmunerkrankungen scheint PA28gamma involviert zu sein. Daher sollte ein Sandwich-ELISA zur Quantifizierung von PA28gamma in humanen Seren entwickelt und anschließend die Relevanz von PA28gamma als diagnostischer und prognostischer Marker bei diesen Erkrankungen untersucht werden. Es konnte in allen getesteten Tumor- bzw. Autoimmunerkrankungen erhöhte PA28gamma-Serumlevel detektiert werden. Der Vergleich von Patienten mit rheumatoider Arthritis, die mit Abatacept behandelt wurden, ergab, dass das PA28gamma-Serumlevel signifikant mit dem Krankheitsaktivitätsindex (DAS28, disease activity score 28) und dem Entzündungsparameter ESR (Erythrozytensedimentationsrate) korreliert. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass das PA28gamma-Serumlevel in den untersuchten Erkrankungen erhöht, aber nicht krankheitsspezifisch ist. Bei Patienten mit rheumatoider Arthritis kann PA28gamma als neuer zusätzlicher Marker für den Verlauf der Erkrankung bzw. für die Untersuchung des Therapieverlaufs eingesetzt werden, da das PA28gamma-Serumlevel mit den spezifischen Markern für diese Erkrankung korreliert. Die Kenntnis über die genaue Bindungsstelle eines Autoantikörpers an ein Autoantigen ist für das Verständnis von Autoimmunerkrankungen und zur Entwicklung von Antikörper- basierten Assays bzw. Therapien von großem Nutzen. Daher sollte u.a. mit Hilfe des für den Sandwich-ELISA hergestellten PA28gamma-Hyperimmunserums validiert werden, ob ein Microbead-basierter Multiplex-Immunoassay zum Epitopmapping von Antikörpern eingesetzt werden kann. Dabei wurden Streptavidin-beschichtete, Fluoreszenz- und Größen-codierte Microbeads mit überlappenden, biotinylierten Peptiden des Antigens beladen und mit dem zu testenden Serum inkubiert. Der Multiplex-Immunoassay identifizierte die gleichen Peptide wie ein entsprechender ELISA. Mit dem erfolgreich validierten Microbead-basierten Multiplex-Immunoassay ist es gelungen ein kostengünstiges und zeitsparendes Verfahren zum Epitopmapping von Antikörpern zu etablieren.

Proteasome activator PA28gamma is an important regulator of many cellular processes among them proliferation, DNA damage response and tumor development. Different studies demonstrated that PA28gamma is also involved in apoptosis but the underlying mechanism has not been investigated yet in detail. The aim of the study was to study the impact of PA28gamma on characteristic apoptotic events. Therefore, we employed cell lines with gain of function and miRNA- mediated gene silencing. It has been demonstrated that PA28gamma affects characteristic apoptotic events in vitro. In detail, under apoptotic conditions PA28gamma leads to an accumulation of mitochondrial cytochrome c, to an inhibition of caspase activity, to an enhanced phosphorylation of nuclear p53, and consequently to a reduction of apoptosis. The results of this study and the resulting hypothesis provide the basis for further investigations of the anti-apoptotic role of PA28gamma. Different tumors are associated with enhanced PA28gamma expression. Furthermore, PA28gamma is also involved in systemic autoimmune diseases. Therefore, the aim of this study was to develop a PA28gamma-specific sandwich ELISA for the quantification of PA28gamma in human sera. In addition, it was intended to use this ELISA to investigate the relevance of PA28gamma as a diagnostic and prognostic marker in different tumor and autoimmune diseases. The developed sandwich ELISA was able to detect enhanced levels of PA28gamma in all investigated sera of tumor and autoimmune diseases. Comparison of patients with rheumatoid arthritis, which were treated with abatacept, showed that PA28gamma sera level significantly correlates with the disease activity score 28 (DAS28) and the inflammation parameter ESR (erythrocyte sedimentation rate). The results obtained in this study reveal that PA28gamma is elevated in the sera of patients with tumor or autoimmune diseases but, unfortunately, this is not diseases specific. However, PA28gamma correlates with different markers of rheumatoid arthritis and could be a new additional marker for the investigation of progression and treatment of this disease. To understand autoimmune diseases and to develop appropriate assays and immune therapies, the knowledge of the antibody binding site is important. The aim of this study was to validate if a microbead-based multiplex immunoassay can be used for epitope mapping of antibodies. Therefore, recombinant synthesized overlapping peptides were coupled via biotin with streptavidin-coated, fluorescence- and size-encoded microbeads and incubated with the sera. The multiplex immunoassay was able to detect the same peptides as a corresponding sandwich ELISA. The results of this study reveal a fast and inexpensive method for epitope mapping of antibodies.