Charakterisierung verschiedener Formen des Leishmania Kmp-11 Proteins

Abstract

Das Kmp-11 Protein ist ein hochkonserviertes Protein innerhalb der Kinetoplastiden. Durch seine nachgewiesene hohe Immunogenität steht Kmp-11 seit langem im Fokus für die Entwicklung neuer Therapieansätze gegen viszerale Leishmaniose beim Menschen. Die Funktion des Proteins ist bisher jedoch noch nicht geklärt. Sequenzanalysen zeigten, dass in verschiedenen Spezies von Leishmanien der Kmp-11 Locus unterschiedlich aufgebaut ist. Das Kmp-11 wird durch mehrere Gen-Kopien kodiert, die z.B. im Fall von L.infantum zusätzlich einen Polymorphismus aufweisen und zur Expression von zwei unterschiedlichen Varianten des Kmp-11 führen, einmal mit den C-terminalen Aminosäuren YPSK und einmal mit NMCK. In der vorliegenden Arbeit wurde der Kmp-11 Locus verschiedener Leishmania Spezies detailliert analysiert. Um weitere Kenntnisse über das Protein zu gewinnen, wurden beide Varianten des Kmp-11 auf zell- und molekularbiologischer sowie auf proteinchemischer Ebene untersucht. PCR- und Sequenzanalysen wiesen erstmals das Vorhandensein von Kmp-11-NMCK Sequenzen im Genom von L.tropica und L.aethiopica nach. Zudem konnten sowohl bei L.donovani, L.tropica als auch bei L.aethiopica erstmals auch zwei Kmp-11-YPSK Sequenzen gefunden werden, wodurch gezeigt werden konnte, dass der Kmp-11 Locus ähnlich dem des schon bekannten L.infantum aufgebaut ist. Die Alignments der Kmp-11 Nukleotidsequenzen zeigten, dass L.tropica mehr Homologien in den Kmp-11 Sequenzen zu L.aethiopica aufweist als zu L.infantum. Eine Überexpression von Kmp-11-YPSK und Kmp-11-NMCK ergab, dass beide Proteine in Leishmanien gleich lokalisiert sind. Infektionsversuche mit humanen Makrophagen zeigten, dass eine Überexpression von Kmp-11-YFP im Vergleich zu einer Überexpression von YFP allein, einen inhibierenden Effekt auf die Infektiosität der Parasiten hat. Ein differenzieller Einfluss von Kmp-11-YPSK und –NMCK war hierbei nicht zu beobachten. Ein Knock-down des Kmp-11 führte zu keiner Änderung der Infektiosität, was vermuten lässt, dass Kmp-11 nicht an den unmittelbaren Mechanismen der Infektion von Zellen durch den Parasiten beteiligt ist. Eine verminderte Expression von Kmp-11 führte allerdings zu einer signifikanten Verlängerung der Generationszeit der Leishmanien. In vitro Analysen mit aufgereinigtem Kmp-11 zeigten deutlich, dass das Kmp-11-NMCK im Gegensatz zu Kmp-11-YPSK in der Lage ist Dimere zu bilden. Eine Dimerisierung in vivo könnte für eine differentielle Funktion des Kmp-11-NMCK gegenüber -YPSK sprechen.

The Kmp-11 protein is a highly conserved protein within the kinetoplastids. Through its proven high immunogenicity Kmp-11 has long been in the focus for the development of new therapeutic approaches against visceral leishmaniasis in humans. However, the function of the protein has not yet been clarified. Sequence analysis showed that in different species of Leishmania the Kmp-11 locus is structured differently. The Kmp-11 is encoded by multiple gene copies, which show for example in the case of L.infantum an additional polymorphism and lead to the expression of two different variants of the Kmp-11, with either the C-terminal amino acids YPSK or NMCK. In the present work, the Kmp-11 locus of different Leishmania species was analyzed in detail. In order to gain further knowledge of the protein, both variants of the Kmp-11 were investigated on cellular and molecular biological, as well as on protein chemical level. PCR and sequence analysis first revealed the presence of Kmp-11-NMCK sequences in the genome of L.tropica and L.aethiopica. In addition, two copies of the Kmp-11-YPSK sequences were found for the first time in L.donovani, L.tropica as well as L.aethiopica, indicating that the Kmp-11 locus is similar to that of the already known L.infantum. The alignments of the Kmp-11 nucleotide sequences showed that L.tropica has more homologies in the Kmp-11 sequences to L.aethiopica than to L.infantum. Overexpression of Kmp-11-YPSK and Kmp-11-NMCK indicated that both proteins are localized similar in Leishmania. Infection experiments with human macrophages showed that overexpression of Kmp-11-YFP has an inhibiting effect on the infectivity of the parasites in comparison to overexpression of YFP alone. A differential effect of Kmp-11-YPSK and –NMCK was not observed. A knock-down of the Kmp-11 resulted in no change in infectivity, suggesting that Kmp-11 is not involved in the direct mechanisms of infection of cells by the parasite. Decreased expression of Kmp-11, however, resulted in a significant prolongation of the generation time of Leishmania. In vitro analyses using purified Kmp-11 clearly demonstrated that the Kmp-11-NMCK unlike Kmp-11-YPSK is able to form dimers. Dimerization in vivo could indicate for a differential function of the Kmp-11-NMCK compared to -YPSK.