Die wax9-Genfamilie; Klonierung, Expression und funktionale Charakterisierung von Lipidtransfer und Kryoprotektion

Abstract

Kryoprotektine sind Polypeptide, die zur LTP-Proteinfamilie gehören. Diese Proteinfamilie besteht bei B. oleracea aus fünf Polypeptiden, die als WAX9-Protein bezeichnet werden. Von diesen fünf Proteinen wurden in dieser Arbeit vier Proteine auf ihre LTP- bzw. Frostschutz-Eigenschaften, ihre Bindungsfähigkeiten an die Thylakoidmembranen und ihr Molekulargewicht hin untersucht. Neben den WAX9-Proteinen wurde das aus gehärteten Wirsingkohlblättern gewonnene CPP mitgeprüft. Wegen der auftretenden Schwierigkeiten und der geringen erhaltenen Proteinausbeute mit der Verwendung von prokaryotischen E. coli-Expressionssystem habe ich in dieser Arbeit das eukaryotische Expressionssystem in Pichia pastoris verwendet. Nach der Entwicklung des Reinigungsvorgangs über eine Amberlitesäule konnte ich die rekombinanten WAX9-Protein bzw. das aus Wirsingkohlblättern isolierte CPP in trockener und löslicher Form erhalten, die bis 4 Monate aktiv bleiben können. In Rahmen dieser Arbeit könnte ich in vitro zeigen, dass neben der Ähnlichkeit in der Sequenz die beiden WAX9A und WAX9E sehr ähnlich in ihren Aktivitäten waren. Beide zeigten eine hohe Lipidtransfer-Aktivität und besaßen keine Frostschutzaktivität. Die Bindungsfähigkeit von beiden lipidtransferaktiven Proteinen an die Thylakoidmembranen war schwach. Ebenfalls verhielten sich die weiteren Proteine WAX9B und WAX9D, die in der Nucleotidsequenzen auch ähnlich sind, wie die Kryoprotektine und zeigten im Gegensatz zu den vorherigen Proteinen keine Lipidtransferaktivität. Diese beiden kryoprotektiven Proteine zeigten in vitro eine starke Bindung an die Thylakoidmembranen sowie eine Resistenz gegen die Waschungsschritte. Das CPP zeigt einen hohen Schutz von 70 % der Thylakoidmembranen gegen Frost und auch eine deutliche starke Bindung an die Thylakoidmembranen, besitzt aber in vitro keine Lipidtransferaktivität. Es konnte kein Mitglied der WAX9-Proteine identifiziert werden, das die beiden Eigenschaften von Kryoprotektion und Lipidtransferaktivität besitzt, was zu einer klaren funktionalen Unterscheidung von Kryoprotektin und LTP führt. Durch die Computersimulation der Bindung von Proteinen an die Membranen konnte Herr Dr. De Lamotte vorhersagen, dass zwei Aminosäuren bei der kryoprotektiven WAX9D (an Position 27 des reifen Proteins ein Threonin (T) und an Position 35 ein Serin (S)) eine vermutete Rolle bei der Bindung an die Membranen spielen können. Diese beiden Aminosäuren würden einzeln und zusammen durch die gerichtete Mutagenese zwischen dem kryoprotektiven WAX9D und lipidtransferaktiven WAX9E vertauscht und geprüft, wobei die Aminosäuresequenz von WAX9D erhalten blieb. Die beiden einzelnen Mutanten zeigten keinen Unterschied in ihrer Frostschutz- und Lipidtransferaktivität sowie in ihrer Bindungsfähigkeit an die Thylakoidmembranen, verglichen mit dem kryoprotektiven WAX9D. Eine deutliche Änderung zeigte die doppelte Mutante in beiden Aminosäuren. Sie hat deutlich ihre Frostschutzaktivität sowie ihre Bindungsfähigkeit an die Thylakoidmembranen verloren und hat eine schwache Lipidtransfer-Aktivität gewonnen.

Cryoprotectins are polypeptides that belong to the lipid transfer protein family (LTP). This protein family consists from five polypeptides in B. oleracea, which are called WAX9 protein. Of these five proteins in this work four proteins were tested for lipid transfer or cryoprotective properties, their binding abilities to the thylakoid membranes and their molecular weight. Cryoprotectin (CPP) isolated from hardened cabbage leaves was used as a positive control. WAX9 proteins were expressed in Pichia pastoris and purified by reverse phase chromatography. The purified proteins remained active for at least 4 months. In this work, I could show in vitro that in addition to the similarity in the nucleotide sequence the two WAX9A and WAX9E proteins were very similar in their activities. Both showed a high degree of lipid transfer activity and had no cryoprotective activity. The binding capacity of two lipid transfer proteins to the thylakoid membranes was weak. The other two proteins WAX9B and WAX9D, which are similar in nucleotide sequence, behaved as cryoprotectins and showed no lipid transfer activity. These two cryoprotective proteins showed in vitro strong binding to the thylakoid membranes. The WAX9 proteins studied had either lipid transfer or cryoprotective activity but not both activities, resulting in a clear functional distinction between cryoprotection and lipid transfer. Molecular modelling of the binding of proteins to the membranes (Dr. De Lamotte, personal communication) predicted that two amino acids in the cryoprotective WAX9D (position T27 and S35 of the mature protein) play a crucial role in the binding to the membranes. These two amino acids were exchanged individually and together by directed mutagenesis. When the corresponding amino acids from the lipid transfer protein WAX9E were inserted at positions 27 and 35 of the cryoprotective WAX9D protein, the single amino acid substitutions did neither change the cryoprotective behavior of WAX9D, nor did they increase the residual lipid transfer activity. The double mutant, however, lost cryoprotective activity and gained a weak lipid transfer activity. The experimental results confirmed the prediction from molecular modelling about the strength of membrane binding of the WAX9 proteins and also showed the close correlation between weak membrane binding and lipid transfer activity versus strong membrane binding and cryoprotective activity.