The role of the secretory pathway for the mammalian circadian clock

Abstract

Circadian clocks are ubiquitous timekeeping mechanisms that are present in all species and have evolved to adapt organisms to a changing environment with a 24-hour light-dark cycle. The circadian network is constructed in a hierarchical manner, with the SCN as the master clock in the brain which synchronises slave oscillators in the periphery through humoral signals, temperature cycles and feeding-fasting rhythms. Together, the circadian oscillators regulate a variety of physiological, metabolic and behavioural processes throughout the body. How cell-autonomous circadian clocks in peripheral tissue resist exogenous fluctuations in synchronising signals and keep a stable phase and period coherence is so far unknown. Over the years, intercellular coupling involving secreted paracrine signalling molecules has been proposed, but its existence is highly debated. Here, we show for the first time that the secretory pathway is important for the generation of normal circadian rhythms. Using RNA interference and pharmacological inhibitors, we perturbed early stages of vesicular protein transport, which led to a drastic lengthening of the circadian period and a reduction in the circadian rhythms’ amplitude. Further, we collected evidence that the anterograde protein transport is the most important route for the circadian clock through genetic rescue experiments. This strengthens our hypothesis that secreted signalling molecules and an unperturbed expression of signalling receptors at the cell surface are necessary for the circadian clock to function. Furthermore, we provide evidence that secreted signalling molecules directly affect the circadian oscillator. Application of conditioned medium from U-2 OS cells immediately phase-shifted circadian rhythms and caused an induction of CRE-mediated transcription. We speculate that unknown signalling molecules activate immediate early genes, a common pathway to integrate timing information into the clock. Finally, we report a direct connection between a cell culture’s density and its circadian clock’s coupling strength. Low cell density with consequently low concentrations of secreted signalling molecules led to circadian oscillations with longer periods and severely decreased amplitudes. These effects can be rescued using wild-type, but not secretion- deficient U-2 OS cells. This further highlights the importance of the secretory pathway and the presence of paracrine signalling molecules for circadian period and phase coherence through coupling in peripheral tissues.

Zirkadiane Uhren sind allgegenwärtig und in nahezu jeder Spezies zu finden. Sie haben sich evolutionär entwickelt, um Organismen eine Anpassung an den 24 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus zu ermöglichen. Das zirkadiane Netzwerk ist hierarchisch aufgebaut mit dem SCN als Hauptuhr an der Spitze, welcher die Oszillatoren in den peripheren Organen durch lösliche Faktoren im Blut, Temperaturzyklen und tageszeitlich gesteuerte Nahrungsaufnahme synchronisiert. Zusammen steuern die zirkadianen Uhren eine Vielzahl an physiologischen und metabolischen Prozessen im Körper sowie unsere Aktivitäts- und Ruhephasen. Wie zellautonome, zirkadiane Uhren in peripheren Geweben sich vor störenden Fluktuationen in exogenen Synchronisationsfaktoren schützen um eine stabile, zirkadiane Periode und Phase zu bewahren, ist bisher nicht ausreichend aufgeklärt. In den vergangenen Jahren wurde in diesem Zusammenhang über die Existenz von interzellulärer Kopplung der zirkadianen Uhren spekuliert, aufrecht erhalten durch sekretierte, parakrine Faktoren. Im Rahmen dieser Doktorarbeit zeigen wir erstmalig die Wichtigkeit des sekretorischen Transportweges für die zirkadiane Uhr. Durch den Einsatz von RNA-Interferenz und pharmakologischen Inhibitoren störten wir den vesikulären Transport zwischen Golgi und ER, was zu einer drastischen Periodenverlängerung und einer Verringerung der Amplitude des zirkadianen Oszillators führte. Darüber hinaus, konnten wir zeigen, dass vor allem der anterograde Proteintransport wichtig für 24-Stunden Rhythmen ist. Dies bestärkt uns in dem Glauben, dass die Sekretion von Signalmolekülen und die unveränderte Expression von Oberflächenrezeptoren für die Aufrechterhaltung von zirkadianen Oszillationen notwendig sind. Zusätzlich liefern wir Hinweise darauf, dass sekretierte Signalmoleküle den zirkadianen Oszillator direkt beeinflussen. Die Applikation konditionierten Mediums von U-2 OS Zellen bewirkte eine sofortige Phasenverschiebung in der Expression von Leuchtkäfer-Luziferase in U-2 OS Reporterzellen. Zudem beobachteten wir eine Aktivierung von CRE-vermittelter Genexpression nach Zugabe von konditioniertem Medium. Wir vermuten, dass über diesen Signalweg die Transkription von „immediate early genes“ induziert wird, welche auch bei der Integration von anderen externen Signalen in den zirkadianen Oszillator eine zentrale Rolle spielen. Abschließend verknüpfen wir die Dichte mit der Kopplungsstärke einer Zellkultur. Bei abnehmender Zellzahl und damit einhergehender Reduktion von sekretierten Faktoren verlängert sich die Periode und verringert sich die Amplitude zirkadianer Rhythmen. Diese Effekte können durch die Zugabe von wild-typ Zellen, nicht jedoch durch sekretionsdefiziente Zellen wieder umgekehrt werden. Diese Erkenntnisse betonen abermals die Wichtigkeit des sekretorischen Transportwegs und einer ausreichenden Menge an sekretierten Signalmolekülen für die Aufrechterhaltung von stabilen zirkadianen Perioden und Phasen durch die Kopplung zirkadianer Oszillatoren in peripheren Geweben.