Die Bedeutung der Tissue Factor-abhängigen Signaltransduktion für die zelluläre Funktion der Kardiomyozyten

Abstract

Der programmierte Zelltod, die Apoptose, tritt unter anderem bei verschiedenen Herzkrankheiten wie bei einem Myokardinfarkt, einer Hypertrophie oder einer Hypoxie im Herzgewebe auf. Generell werden pathologische Veränderungen im Herzen auch durch apoptotische, nicht mehr funktionsfähige, Kardiomyozyten hervorgerufen. Es ist daher von großem medizinischen Interesse, solche Proteine oder Signaltransduktionswege zu identifizieren, die die Induktion des Apoptoseprozesses in Kardiomyozyten hemmen bzw. verhindern können und dadurch zum Erhalt der Funktionalität des Herzens beitragen. Da Tissue Factor (TF), der Initiator der Blutkoagulationskaskade, im Herzgewebe mit Strukturproteinen ko-lokalisiert vorliegt und zudem auch einen Einfluss auf diverse Signaltransduktionswege besitzt, wurde vermutet, dass TF auch für den Erhalt der Vitalität der Zellen entscheidend sein könnte. Diese Vermutung wurde durch die Feststellung des Sachverhaltes gestützt, dass bei dilatativer Kardiomyopathie weniger TF im Herzgewebe vorliegt als in gesundem Herzgewebe; beide TF-Isoformen zeigten sich dabei deutlich herunterreguliert. Da auch asTF, die alternativ gespleißte TF-Isoform, im dilatierten Herzen weniger exprimiert war, scheint auch asTF Einfluss auf die Kardiomyozyten zu haben. Die Funktion und Bedeutung von asTF in Kardiomyozyten ist bisher gänzlich unbekannt, lediglich in Tumorzellen wurde eine das Wachstum und die Angiogenese fördernde Wirkung von asTF nachgewiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde anhand von asTF-überexprimierenden HL-1 Zellen gezeigt, dass asTF eine entscheidende Bedeutung sowohl für die Proliferation als auch für das Apoptoseverhalten der Kardiomyozyten hat. Die erhöhte asTF-Expression führte zu einem schnelleren Zellwachstum und zum Schutz der Zellen vor dem programmierten Zelltod. Unabhängig von dem dabei induzierten Apoptoseweg steigerte die asTF-Überexpression das Überleben der Zellen in signifikantem Ausmaß. In den überexprimierenden Zellen war außerdem der PI3K-/Akt- Signaltransduktionsweg kontinuierlich aktiviert. Daher ist anzunehmen, dass das durch die Überexpression von asTF ausgelöste Verhalten der Zellen über die Aktivierung des PI3K-/Akt-Signalweges reguliert wird. Da anti-apoptotisches Bcl-xL in den Zellen stärker transkribiert und translatiert wurde, scheint ebenso das Gleichgewicht in der Bcl-2 Proteinfamilie für die durch asTF vermittelten Effekte entscheidend zu sein. Die im Rahmen dieser Arbeit ermittelten Daten lassen darauf schließen, dass asTF in HL-1 Zellen die Aktivierung des PI3K-/Akt-Signalweges bewirkt und dass asTF direkt oder über den PI3K-/Akt-Weg vermittelt die Expression von Bcl-2 Proteinen reguliert, was letztendlich zu der höheren Vitalität der Zellen führt. Diese Zusammenhänge konnten ex vivo an primären Kardiomyozyten bestätigt werden. Auch in den primären Zellen führte die Überexpression von asTF zu einem Schutz der Zellen gegenüber dem durch TNFα induzierten Zelltod. Der PI3K-/Akt- Signaltransduktionsweg erwies sich in den asTF-überexprimierenden Zellen als stärker aktiviert. Die Expression von anti-apoptotischem Bcl-2 und Bcl-xL war nach der TNFα-Stimulation nur in den asTF-überexprimierenden Zellen signifikant erhöht. Diese Ergebnisse weisen erneut darauf hin, dass asTF eine protektive Funktion in den Kardiomyozyten hat und dass der PI3K-/Akt- Signaltransduktionsweg und die Regulation der Bcl-2 Proteinexpression an dem asTF-abhängigen Schutz der Zellen beteiligt sind. Durch Versuche an transgenen Mäusen, die einen Knockout beider TF-Isoformen aufweisen, wurden diese Erkenntnisse gestützt. Es zeigte sich nämlich, dass Kardiomyozyten, welche aus den transgenen Tieren isoliert worden waren, das genau konträre Verhalten zu den asTF-überexprimierenden primären Kardiomyozyten aufwiesen. Nach TNFα- Stimulation war Apoptose stärker induziert und Bcl-2, Bcl-xL sowie Gesamt-Akt waren weniger stark exprimiert als in den Kontrollzellen. Zusammenfassend ist daher festzustellen, dass asTF eine entscheidende Bedeutung für die Vitalität der Kardiomyozyten besitzt. AsTF schützt die Zellen vor TNFα- oder Camptothecin-induzierter Apoptose. An diesem Einfluss sind die Aktivierung des PI3K-/Akt-Signalweges sowie die verstärkte Expression von anti-apoptotischen Bcl-2 Proteinen anscheinend maßgeblich beteiligt. Darüber hinaus wurde im Rahmen dieser Arbeit gezeigt, dass die asTF-Expression mit der Transkription von FGF-2 und Cyr61 korrelierte. Wegen dieser anscheinend asTF-abhängigen Regulation der Angiogenese-assoziierten Proteine FGF-2 und Cyr61 könnte asTF auch eine wichtige Bedeutung für die Angiogenese zukommen. Zudem sind FGF-2 und Cyr61 Proteine, die Einfluss auf den Akt-Signaltransduktionsweg ausüben. Daher könnte asTF auch über die Regulation dieser Proteine das Verhalten der Zellen gegenüber der Induktion von Apoptose steuern. Die vorliegende Arbeit eröffnet Einblicke in die wichtige protektive Bedeutung, welche die asTF- Isoform in Kardiomyozyten besitzt. Weitere Studien, idealerweise an transgenen Mäusen mit kardiomyozytenspezifischem asTF-Knockout, könnten die Funktion, die asTF in vivo im Herzen erfüllt, bestätigen und klären, ob asTF neben der Vitalität der Zellen auch Prozesse wie die Angiogenese fördert.

Apoptosis, programmed cell death, regularly occurs during different pathological developments in the heart. The loss of intact cardiomyocytes results in the progression of cardiac dysfunction. Myocardial infarction, hypoxia and hypertrophy are associated with the incidence of apoptosis as well. Therefore, it is a matter of great importance to investigate which proteins or signalling pathways have a beneficial impact on cardiomyocytes, thereby contributing to maintain the normal function of the heart. Tissue factor, the initiator of the coagulation cascade, was shown to be co-localized with structure proteins in the human heart. Furthermore, TF has an influence on different signalling pathways and cellular processes. Therefore, it was suggested that TF is associated with the vitality of cardiomyocytes. This presumption could be confirmed by the fact that both TF-isoforms, flTF and asTF, were down-regulated in the myocardium of DCM patients. Since there was also a lower expression of asTF, the alternatively spliced TF-isoform, one can assume that asTF is highly relevant to the vitality of cardiomyocytes. In general, little is known about the physiological function of the asTF-isoform. In recently published studies it has been shown that asTF might have a pro- angiogenic effect on tumour cells. In this thesis asTF was identified as having an important influence on the proliferation rate and on the survival of cardiomyocytes. On the basis of asTF-over-expressing HL-1 cardiomyocytes, asTF was shown to display a distinct anti-apoptotic effect on the cells. Additionally, the over-expression caused a higher proliferation rate of these cardiomyocytes. The anti-apoptotic effect was independent of the aspect which apoptosis pathway – extrinsic or intrinsic – had been induced. Moreover, a continuous activation of Akt was associated with asTF-expression. In contrast, mock-transfected HL-1 cells developed Akt-activation only after TNFα- stimulation. These results indicate a causal connection between the asTF expression level and the activation of Akt. Furthermore, it was demonstrated that Bcl-xL-expression was increased in stimulated over-expressing cells, whereas control cells displayed no changes in the expression levels of Bcl-2 proteins. This indicates that, in addition to the Akt-pathway, Bcl-xL takes part in the downstream effects on asTF-over-expression and is also involved in the asTF-induced anti-apoptotic impact on the cells. To confirm the conclusions based on the in vitro-experiments, ex vivo-investigations were performed. AsTF-over-expressing primary cardiomyocytes displayed the same anti-apoptotic effect as over-expressing HL-1 cells. The Akt-pathway was higher activated in asTF-overexpressing cells under normal conditions. Moreover, upon TNFα-stimulation the expression of the anti-apoptotic Bcl-2 proteins Bcl-xL and Bcl-2 was elevated only in over-expressing cells. These results underpinned the association between asTF-dependent effects and the Akt-pathway on the one hand and the Bcl-2 protein expression on the other hand. Primary cells, possessing a specific TF-knockout, affirmed these results by the fact that these cells showed the opposite features of asTF-over- expressing cardiomyocytes: In TF-knockout cells, Bcl-2 and Bcl-xL expression levels were decreased, total Akt was transcribed and activated to a lower degree. Thus, this positive correlation between the TF-expression and anti- apopototic processes was reaffirmed. It was also a further matter of interest to find out whether asTF has an effect upon angiogenic processes. In this work a positive correlation was detected between the asTF-protein expression and transcription levels of the angiogenesis-associated proteins FGF-2 and Cyr61. This indicates that asTF might have an influence on angiogenesis. Additionally, in previous studies it has been described, that Cyr61 can activate the PI3K-/Akt-signalling pathway. Thus, it seems to be very likely that elevated FGF-2 and Cyr61-expression are also elements of the asTF- dependent anti-apoptotic impact on cardiomyocytes. In conclusion, the findings of this work show that asTF impacts on FGF-2 and Cyr61-expression, on the PI3K -/Akt-pathway and on the expression balance between pro- and anti-apoptotic Bcl-2 proteins. In cardiomyocytes these influences are likely to prevent the activation of the caspase cascade and consequential apoptosis. Therefore, asTF is of particular importance for the survival of cardiomyocytes and may contribute to maintain the normal function of the heart. Experiments on the basis of mice possessing a cardiomyocyte-specific asTF-knockout would be a useful tool to confirm the results in vivo and to clarify whether asTF, associated with its beneficial effects, could be a valuable target for medical intervention in the future.