Untersuchung der fibrotischen Effekte des Dopaminagonisten Cabergolin an Herzklappen des Schweins

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Mechanismen der Nebenwirkungen von Carbergolin und anderen Vertretern der Ergoline zu untersuchen, die zu fibrotischen Veränderungen der Herzklappen führen. Herzklappenfibrosen treten insbesondere bei der Therapie von M. Parkinson auf und führen zu Regurgitationen am Herzen und im weiteren Verlauf zu einer Herzinsuffizienz. Für die betroffenen Patienten bleibt als einzige Therapiemöglichkeit derzeit der chirurgische Ersatz der geschädigten Herzklappen durch künstliche Herzklappen. Solche pathologische Veränderungen wurden auch im Zusammenhang mit anderen Beeinflussungen des serotonergen Systems beobachtet, wie der Anwendung von Appetitzüglern mit Amphetamin-Struktur wie z.B. Fenfluramin oder beim Karzinoid-Syndrom, einer Tumorerkrankung mit übermäßig erhöhtem Serotonin-Plasmaspiegel. Nachdem in einer früheren Veröffentlichung der Arbeitsgruppe Prof. Pertz die pharmakophore Struktur des Ergolins Pergolid identifiziert wurde, die für den Agonismus an 5-HT2A- und 5-HT2B-Rezeptoren verantwortlich ist, wurden im ersten Teil der vorliegenden Arbeit die pharmakologischen Eigenschaften am 5-HT2A- sowie am 5-HT2B-Rezeptor von Cabergolin und seiner an der Position 6 modifizierten Derivate mithilfe von funktionellen Organbadstudien erfasst. Es konnte gezeigt werden, dass die Größe der Seitenkette in Position 6 des Cabergolinmoleküls über die pharmakologischen Eigenschaften an diesen Rezeptoren bestimmt. Cabergolin sowie die Derivate mit voluminöseren Substituenten verhielten sich wie Agonisten oder potente Partialagonisten, wohingegen Derivate mit kleinen Substituenten wie 6-Methylcabergolin zu Antagonismus an beiden Rezeptoren führten. Eine [35S]GTPγS-Bindungs-Studie bewies, dass 6-Methylcabergolin die gewünschten pharmakologischen Eigenschaften an den D2L- und D2S-Rezeptoren beibehielt. In weiteren Organbadstudien konnte gezeigt werden, dass Cabergolin oder 5-HT Kontraktionen an isolierten Aortenklappensegeln des Schweins auslösen. Um die Beteiligung der verschiedenen 5-HT-Rezeptortypen an diesem Effekt von Cabergolin zu untersuchen, wurden Experimente mit selektiver Rezeptorblockade durchgeführt. Dabei konnte eine Beteiligung des 5-HT2A- Rezeptors an den kontraktilen Effekten in diesem Gewebe gezeigt werden, nicht jedoch eine Beteiligung von 5-HT2B- und 5-HT1B-Rezeptoren. Die Cabergolin- induzierte Kontraktion der Aortenklappensegel konnte durch Inhibitoren der ERK 1/2 Kinasen und der Src-Tyrosinkinasen gehemmt werden und zeigte somit eine Beteiligung beider intrazellulärer Signalwege. Da eine Beeinträchtigung der korrekten Form und Funktionsfähigkeit intakter Herzklappen durch die direkten kontraktilen Effekte von 5-HT bereits in der Literatur gezeigt wurde, legt die vorliegende Arbeit die Vermutung nahe, dass die mechanischen Effekte von Cabergolin Teil des pathologischen Mechanismus sind. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden Interstitialzellen (VICs) der Aorten- und Mitralklappe des Schweins isoliert. Die VICs sind für die Synthese und Umbau der ECM in den Herzklappen verantwortlich. Eine übermäßige Akkumulation von ECM-Komponenten wie Kollagen und Glykosaminoglykan, sowie eine erhöhte Proliferationsrate der VICs sind charakteristische Merkmale fibrotischer Veränderungen. Eine Inkubation der VIC’s mit Cabergolin oder 5-HT führte, wie erwartet, zu einer erhöhten Biosynthese von Kollagen und Glykosaminoglykan. Dieser stimulierende Effekt von Cabergolin war konzentrationsabhängig. Während einige Veröffentlichungen zu Serotonin- und Fenfluramin-induzierten fibrotischen Veränderungen eine Beteiligung des 5-HT2B-Rezeptors nahelegen, zeigten die Experimente mit selektiver Rezeptorblockade und Rezeptoraktivierung in dieser Arbeit, dass zumindest die stimulierenden Effekte auf die ECM nicht durch 5-HT1B- oder 5-HT2B-Rezeptoren, sondern durch 5-HT2A-Rezeptoren vermittelt werden. Ein vollständiges Ausbleiben der erhöhten Biosynthese durch 5-HT2A- Rezeptorblockade konnte nicht erreicht werden. Das deutet auf einen oder mehrere zusätzliche alternative Stimulationsmechanismen hin. Bei der serotonergen Stimulation der ECM-Synthese wird durch die Aktivierung der Src- Tyrosinkinasen das Signal vom Rezeptor übertragen. Obwohl 6-Methylcabergolin sich als ein 5-HT2A- und 5-HT2B-Antagonist erwiesen hatte, zeigte die Substanz trotzdem einen stimulierenden Effekt auf die ECM-Synthese. Das deckt sich mit der Vermutung, dass zusätzliche Mechanismen an der Entstehung einer Herzklappenfibrose beteiligt sind, da die Wirkung von 6-Methylcabergolin deutlich schwächer als im Vergleich zu Cabergolin ausfiel. Cabergolin führte zu einer konzentrationsabhängigen Erhöhung der Phosphorylierung der ERK 1/2 Kinasen. Die Aktivierung der ERK-Signalwege ist ein früher Schritt bei fibrotischen Prozessen der Herzklappen und wird durch 5-HT2A- und 5-HT1B- Rezeptoren in den VICs vermittelt. Die Proliferationsrate der VICs wurde durch eine Inkubation mit Cabergolin oder 5-HT erhöht. Der Zusatz eines Hemmstoffs der ERK 1/2 Aktivierung verhinderte die Zunahme der Proliferation. Dies zeigt, dass die mitogenen Signale von Serotonin in den VICs durch ERK 1/2 Kinasen übertragen werden. Tergurid ist ein weiterer Vertreter der Ergoline, der bis jetzt nicht mit Valvulopathien assoziiert wurde. Die Verbindung war von besonderem Interesse, da sie eine Methylgruppe als Substituent in Position 6 besitzt und über antagonistische Eigenschaften an den 5-HT2A- und 5-HT2B- Rezeptoren verfügt. Mit Tergurid wurde in Koinkubationsstudien die profibrotische Wirkung von Serotonin hinsichtlich der Aktivierung der ERK 1/2 Signalwege und der Kollagenbiosynthese reduziert. Auch diese Untersuchung bestätigt die Hypothese, dass die Seitenkette in Position 6 des Ergolin- Grundgerüstes eine zentrale Bedeutung für die pharmakologischen Eigenschaften am 5-HT2A- und 5-HT2B-Rezeptor und damit für die fibrotischen Veränderungen an den Herzklappen hat. In der Literatur wird zwar die Aktivierung der 5-HT2B- Rezeptoren als die primäre Ursache für die Arzneimittel-induzierten Valvulopathien betrachtet. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch gezeigt werden, dass auch der 5-HT2A-Rezeptortyp ein fibrotisches Potential hat. Darüber hinaus zeigte die Untersuchung der Cabergolin-induzierten frühen fibrotischen Veränderungen in VICs, dass es weitere Mechanismen geben muss, über die Ergoline eine Herzklappenfibrose auslösen können.

The aim of this study was to examine the side effect mechanisms of cabergoline and other ergoline compounds that cause fibrotic changes in heart valves. Heart valve fibrosis occurs during treatment of Parkinson’s disease and may cause regurgitation and even heart failure. To this date, surgical replacement with artificial valves is the only long term treatment option for patients with diseased heart valves. These pathological changes were observed in association with other influences on the serotonergic system such as the use of appetite suppressants like fenfluramine and with the carcinoid syndrome, a tumour disorder causing high serotonin plasma levels. The molecular fragment of pergolide responsible for its agonism at the 5-HT2A and 5-HT2B receptors was identified in a previous study by the group of Prof. Pertz. In the initial part of the present study, the pharmacological properties of cabergoline and its derivatives with modified N(6)-substituents were determined both at 5-HT2A and 5-HT2B receptors using functional organ bath assays. It has been shown that the size of the side chain at N(6) in the molecule of cabergoline plays a crucial role for its pharmacological properties at these receptors. Cabergoline and its derivatives with bulky moieties behaved as agonists or high potency partial agonists, whereas derivatives with smaller moieties such as 6-methylcabergoline led to antagonism with both receptors. 6-Methylcabergoline retained the desired pharmacological properties at D2L und D2S receptors relative to cabergoline as shown in a [35S]GTPγS-binding assay. Further organ bath assays demonstrated that cabergoline or 5-HT induce contractions in isolated porcine aortic valves. Experiments with selective receptor inhibition were performed in order to determine the 5-HT-receptor type involved in the contractile effect of cabergoline. The 5-HT2A receptor but not the 5-HT1B or 5-HT2B receptors, was shown to participate in this effect. Cabergoline-induced contraction of aortic valve cusps was reduced in the presence of selective inhibitors of Erk 1/2 kinase and Src-tyrosine- kinase, which showed the involvement of both intracellular signalling pathways. It has been demonstrated by others that the contractile effects of 5-HT lead to functional impairment and changes in the correct geometry of the valves. Thus the present study suggests a participation of the mechanical effects of cabergoline in the pathological mechanism. In the second part of this study, interstitial cells (VICs) were isolated from aortic and mitral porcine valves. VICs are responsible for the production and turnover of the ECM in heart valves. An excessive accumulation of ECM components such as collagen and glycosaminoglycan and high proliferation of VICs are a hallmark pathological feature of fibrosis. As expected when incubated with cabergoline or 5-HT the biological synthesis of collagen and glycosaminoglycan in VICs was increased. The stimulatory effect of cabergoline was concentration-dependent. While some publications dealing with the fibrotic changes induced by serotonin and fenfluaramine point out the involvement of the 5-HT2B receptor, in this research experiments carried out with selective receptor inhibition and activation, indicate that at least the stimulatory effect on the ECM is mediated neither by 5-HT1B nor by 5-HT2B receptor, but by 5-HT2A receptors. However, the blockade of the 5-HT2A receptor failed to induce a total decrease in elevated ECM biosynthesis. This suggests the presence of one or more additional alternative mechanisms of stimulation. The transmission of the signal from the receptor was mediated by activation of the Src-tyrosine kinase during the serotonergic stimulation of the ECM synthesis by 5-HT. Although 6-methylcabergoline acted as an antagonist at 5-HT2A and 5-HT2B receptors it showed a stimulatory effect on ECM synthesis. This is in good agreement with the suggestion of one or more additional mechanisms that must be present for the occurrence of heart valve fibrosis given that the effect of 6-methylcabergoline appeared to be less pronounced compared to cabergoline. Cabergoline increased the phosphorylation of the Erk 1/2 kinases in a concentration-dependent manner. The Erk 1/2 activation is an early step in fibrosis and was mediated by 5-HT2A and 5-HT1B receptors. The proliferation rate of VICs was increased after incubation with cabergoline or 5-HT. The addition of an inhibitor of the Erk 1/2 activation prevented the increase of the proliferation. This shows that in VICs the mitogenic signaling of serotonin is mediated by Erk 1/2 kinases. Terguride is another ergoline compound that has so far not been linked to valvulopathy. This compound was of special interest, as it possesses a methyl substituent at N(6) and an antagonistic activity at the 5-HT2A and 5-HT2B receptors. In co-administration studies, terguride was capable of reducing the fibrotic effects of 5-HT in terms of activation of Erk 1/2 kinases and synthesis of collagen. This effect of terguride in VICs also confirmed the hypothesis of a crucial role of the moiety at position 6 in the ergoline skeleton for the pharmacological properties at 5-HT2A and 5-HT2B receptors and thus for fibrotic heart valve disease. In literature, activation of 5-HT2B receptors is considered to be the main cause for drug-induced valvulopathy; nevertheless, the fibrotic potential of 5-HT2A receptor activation has clearly been demonstrated in the present study. Moreover, this study on cabergoline-induced early fibrotic changes in VICs shows that other mechanisms of development of heart valve fibrosis by ergolines may exist.