Charakterisierung von Tight Junction-Proteinen mit Hilfe eukaryontischer und prokaryontischer Expressionssysteme

Abstract

Epithelien bilden eine Barriere und dienen dem Stofftransport zwischen dem Interstitium des Körpers und der Außenwelt. Die Zellen sind unter anderem durch Tight Junctions miteinander verbunden. Die für die Transport- und Barriereeigenschaften wichtigsten Proteine darin sind die Claudine, eine Familie integraler Transmembranproteine mit zwei extrazellulären Domänen. Eigenschaften des Epithels werden durch Ladungen ihrer extrazellulären Schleifen vermittelt. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob und wie sich die Durchlässigkeit von MDCK-C11 Zellen nach stabiler Transfektion mit Claudin-5-cDNA verändert. Zudem wurden Konstrukte der Claudine-1 und -2 hergestellt, in prokaryontischen Expressionssystemen exprimiert und aufgereinigt. Es sollte geklärt werden, ob sie für Interaktionsanalysen mittels Oberflächen-Plasmonenresonanz (Biacore)- Experimenten geeignet waren. Claudin-5 bildet Tight Junction-Stränge in Endothelzellen, seine zusätzliche Expression kann je nach endogenem Claudin-Expressionmuster den transepithelialen Widerstand erhöhen oder unverändert lassen. In dieser Arbeit wurde es stabil in MDCK-C11 Zellen transfiziert. Der transepitheliale Widerstand der transfizierten Zellen wurde in Ussing Kammern gemessen und mit dem von Leervektor-transfizierten Zellen desselben Klons verglichen. In dieser Arbeit wurde kein Unterschied gemessen. Caco-2-Zellen ähneln in ihren funktionellen Eigenschaften den MDCK-C11 Zellen, Expression von Claudin-5 erhöht jedoch den transepithelialen Widerstand in diesen Zellen. Der Grund könnte die Expression von Claudin-2 sein: Es wird in MDCK-C11 Zellen in hohem Maße synthetisiert, in Caco-2 Zellen nicht. Während Claudin-5 den transepithelialen Widerstand durch Senkung der Kationenpermeabilität erhöhen kann, bildet Claudin-2 kationenselektive Poren und könnte die Claudin-5 vermittelte Beschränkung der Kationenpermeabilität aufheben. Claudin-1 bildet dichte Barrieren, Claudin-2 bildet kationenspezifische Poren. Es wurden 11 kDa große Konstrukte von Claudin-1 und -2 hergestellt, die nur die extrazellulären Schleifen und einen Platzhalter enthielten. Sie wurden unter Anwendung verschiedener Bedingungen in einem prokaryontischen System zur Proteinexpression gebracht und aufgereinigt. In der Western Blot-Analyse wurden die Claudine wiederholt in höheren Banden nachgewiesen. Sie passierten zudem einen größenselektiven Filter, der Proteine > 30 kDa an der Passage hinderte, nicht. Denaturierung durch Zugabe von Urea wies die Proteine ausschließlich in der erwarteten Bande auf. Die in dieser Arbeit untersuchten extrazellulären Loops weisen demnach eine sehr hohe Adhäsion auf, sie waren für die angestrebten Untersuchungen somit nicht geeignet.

Tight Junctions seal the paracellular pathway of epithelia and exhibit specific permeability. Claudins, a family of integral transmembrane-proteins, constitute the back-bone of tight junctions. Transport and permeability are primarily regulated by their two extracellular loops. In this thesis it was studied, whether the permeability of MDCK-C11 cells change due to stable transfection with claudin-5-cDNA. Furthermore, constructs of claudins-1 and -2 were built, expressed in a prokaryotic expression system, and purified. The aim was to determine whether they were suitable for interaction-analysis using surface-plasmon-resonance (Biacore)- experiments. Claudin-5 establishes tight junction- strands in endothelial cells. Overexpression of claudin-5 can raise transepithelial resistance or leave it unaffected, depending on the endogenous expression patterns of claudins. Here, claudin-5 was transfected in MDCK-C11 cells. Transepithelial resistance of the cells was then measured using Ussing- chamber experiments and compared to the resistence of mock- transfected cells of the same clone. No difference was detected. Caco-2 cells resemble MDCK-C11 cells functionally, nevertheless expression of claudin-5 raises transepithelial resistance in these cells. This could be due to the expression of claudin-2: It is synthesized in a large degree in MDCK-C11 cells but is absent in CaCo-2 cells. While claudin-5 may raise transepithelial resistance via reduction of cation- permeability, claudin-2 builds cation- selective pores and might prevent claudin-5 mediated reduction of cation- permeability. Claudin-1 builds tight barriers, while claudin-2 builds cation- selective pores. Here, 11 kDa-constructs of claudin-1 und -2 were built, that consisted of the two extracellular loops and a spacer, only. They were expressed applying various conditions in a procaryotic expression system and then purified. In western blot-analysis claudins were repeatedly detected in various higher protein bands. Furthermore, they did not pass a size-selective filter with a cut-off of 30 kDa. After addition of urea-buffer, proteins were detected in the 11 kDa lane, only. These results suggest that the examined proteins show high adhesion and are not suitable for interaction analyses.