Entwicklung von Secretin- und Glucagon-like peptide-2-Rezeptor-Antagonisten für die Tumordiagnostik

Abstract

Die erfolgreiche Therapie einer Krebserkrankung ist häufig von einer rechtzeitigen Diagnose und dem damit verbundenen rechtzeitigen Behandlungsbeginn abhängig. Eine mögliche Strategie ist dabei die zielgerichtete, bildgebende Diagnostik durch Tumor-bindende Moleküle, die an Kontrastmittel gekoppelt werden. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung von G-Protein-gekoppelten-Rezeptoren (GPCRs), die im Tumor verstärkt exprimiert werden und sich daher als Zielstruktur für eine solche zielgerichtete Diagnostik eignen. Gleichzeitig sollten mögliche Peptidliganden dieser GPCRs hinsichtlich ihrer Länge und Aktivität optimiert werden, um sie als Trägerpeptide einsetzen zu können. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass der humane Secretinrezeptor (SCTR), ein Vertreter der GPCRs der Klasse B, in 93 % aller untersuchten duktalen pankreatischen Adenokarzinome und in 94 % aller untersuchten Plattenepithelkarzinome des Ösophagus stark exprimiert wird, während das umgebende Gewebe nur eine mäßige bis sehr schwache SCTR- Expression aufweist. Dies macht den SCTR zu einem vielversprechenden Zielrezeptor für die zielgerichtete Tumordiagnostik. In einem nächsten Schritt wurde der Ligand des SCTR, das Secretin, und ein zweiter Peptidligand der GPCRs der Klasse B, das Glucagon-like peptide-2 (GLP-2), strukturell charakterisiert und für die zielgerichtete Tumordiagnostik optimiert. Um eine große Anzahl an Peptidvarianten untersuchen zu können, wurde die Methode der β-Arrestin2-GFP Translokation etabliert, die sich als äußerst vielseitig einzusetzende, hoch reproduzierbare und kostengünstige Methode erwies. Dies machte es möglich, eine große Menge an Substitutionsvarianten des Secretin und des GLP-2 zu untersuchen und die Struktur-Aktivitätsbeziehungen beider Peptide näher zu beschreiben. Dabei zeigte sich, dass, wie für die meisten anderen Peptidliganden der GPCRs der Klasse B, die N-Termini der Peptide für die Rezeptor-Aktivierung entscheidend sind. N-terminale Deletionen führten dagegen zu kompetitiven Antagonisten. Da zuvor beschrieben wurde, dass sich antagonistisch wirkende Peptide möglicherweise besser als Trägerpeptide für die zielgerichtete Tumordiagnostik eignen, wurden Modifikationen an N-terminal verkürzten Secretin- und GLP-2-Varianten vorgenommen. Dies führte zu der Entwicklung von drei Secretin-Varianten, die eine antagonistische Aktivität am SCTR mit einer IC50 von etwa 1 µM in der β-Arrestin2-GFP Translokation zeigen. Ein potenterer Antagonist wurde bisher nicht beschrieben. Außerdem konnten in dieser Arbeit hochpotente Glucagon-like peptide-2-Rezeptor (GLP- 2R)-Antagonisten entwickelt werden. Diese sind um sieben Aminosäuren kürzer als der bisher verwendete Antagonist GLP-2(3-33) und in der β-Arrestin2-GFP Translokation etwa sechsfach potenter. Im Gegensatz zu GLP-2(3-33) sind die in dieser Arbeit entwickelten GLP-2-Varianten reine Antagonisten und damit auch für pharmakologische Untersuchungen des GLP-2R einsetzbar. Damit konnte im Rahmen dieser Arbeit mit dem SCTR ein vielversprechender Zielrezeptor für die zielgerichtete Tumordiagnostik identifiziert werden. Die Charakterisierung und Optimierung der Liganden stellt zudem den ersten Schritt zur Entwicklung bindender Trägerpeptiden dar, die in naher Zukunft in ersten in vivo-Versuchen an Tumormodellen der Maus eingesetzt werden können.

The successful therapy of cancer is often tightly linked to early diagnosis and the timely initiation of a therapeutic approach. One strategy of non- invasive cancer diagnosis is the targeting of tumors with specifically binding molecules which are coupled to a contrast agent. Therefore, the main goal of this work was the identification of G protein coupled receptors (GPCRs) which are overexpressed in tumors and can be targeted with specific ligands. Those ligands had to be optimized with regard to their length and activity to make them usable as carrier-peptides. It could be shown in this work that the human secretin receptor (SCTR), which is a member of the class B family of GPCRs, is overexpressed in 93 % of all examined ductal pancreatic adenocarcinomas and in 94 % of esophageal squamous cell carcinomas. In contrast, SCTR is only moderately or poorly expressed in non-cancerous tissues, which makes it a promising molecular target. The next step in this project was the optimization and structural characterization of Secretin, which is the natural ligand of the SCTR, and another peptide ligand of the class B GPCR family, Glucagon-like peptide-2 (GLP-2). To achieve this aim it was necessary to establish a screening method for a large amount of peptide variants. The β-Arrestin2-GFP translocation was the method of choice and has been proven to be extremely flexible, reproducible and cheap. The initial screening of multiple substitution variants of Secretin and GLP-2 led to a general understanding concerning the structure-relationship of both peptides. Importantly, the N-terminal part of both peptides proved to be crucial for their activity at the SCTR and the Glucagon-like peptide-2 receptor (GLP-2R), respectively. Deletion of those N-terminal amino acids resulted in competitive antagonism at their receptors. Because it has been proposed that antagonistic peptide ligands might be more suitable for tumor targeting approaches than agonistic peptides, antagonistic peptides were created by modifying N-terminal deletion variants of Secretin and GLP-2. This led to the development of three secretin variants with an IC50 of around 1 µM in β-Arrestin2-GFP translocation which is the most potent antagonistic response of a peptide currently described for SCTR. Even better antagonists could be developed for the GLP-2R. Those peptides are around seven amino acids shorter than the antagonist which is mainly used at the GLP-2R, the GLP-2(3-33). In the β-Arrestin2-GFP translocation they showed a six-fold improvement in comparison to GLP-2(33-3) which is also a weak partial agonist. The GLP-2R antagonists of this work lack this agonistic activity and are therefore pure antagonists, a fact that makes them also usable for pharmacological studies at the GLP-2R. In conclusion, this work shows that the SCTR is overexpressed in several tumors and is therefore a promising target molecule for both diagnostic and therapeutic approaches. The characterization and optimization of several peptide variants are crucial steps in the development of carrier-peptides specific for their receptors which can hopefully be used in first in vivo experiments in near future.