Auto-Antikörper gegen das 20S Proteasom: Affinitätsreinigung, Immunfluoreszenz und diagnostische Evaluierung

Abstract

Auto-Antikörper spielen für das Verständnis und die Diagnostik von Autoimmunerkrankungen eine Schlüsselrolle. Die vorliegenden Ergebnisse machen deutlich, dass Auto-Antikörper gegen das 20S-Proteasom einen relevanten diagnostischen Marker darstellen. Wichtige Eigenschaften dieser Antikörper wurden durch Affinitätsreinigung und anschließendem Einsatz insbesondere in der indirekten Immunfluoreszenz, dem wichtigsten Standardverfahren zur Auto- Antikörperdiagnostik, aufgedeckt. Mit den beschriebenen Experimenten wurde ein weiterer unabhängiger Beweis zur Existenz von Anti-Proteasomenantikörpern erbracht. In Übereinstimmung zu Vorarbeiten kann davon ausgegangen werden, dass Anti-Proteasomenantikörper signifikant zu dem Pool von Auto-Antikörper bei den untersuchten Autoimmunerkrankungen beitragen. Erstmals ist es ist gelungen, Anti-Proteasomenantikörper aus Patientenseren in reiner Form zu isolieren. Die Ergebnisse beweisen, dass Anti-Proteasomenantikörper spezifisch gegen ihr natives Zielantigen reagieren. Es wurde gezeigt, dass sowohl die untersuchten humanen Auto-Antikörper als auch die verwendeten Referenzantikörper gegen 20S Proteasomen keinen direkten Einfluss auf die Proteasomenaktivität ausüben. Die Methodik der Affinitätsreinigung von Anti- Proteasomenantikörpern stellt die Grundlage für weiterführende biochemische und immunologische Untersuchungen dar. In der indirekten Immunfluoreszenz wurden charakteristische und reproduzierbare Muster aufgedeckt, wobei sich die natürliche Verteilung von Proteasomen in Zytoplasma und Zellkern in einem komplexen Muster widerspiegelt. Durch eine exakte Charakterisierung des Immunfluoreszenzmusters von Anti-Proteasomenantikörpern wurde deutlich, dass es häufig zu Überlagerungseffekten mit etablierten ANA-Mustern kommt. In Folge dessen wird der Nachweis von Anti-Proteasomenantikörpern mittels konventioneller indirekter Immunfluoreszenz im Rahmen der Routinediagnostik deutlich erschwert und stellt hohe personelle Anforderungen. Dennoch ist durch die genaue Kenntnis dieser Eigenschaften ein immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis von Anti-Proteasomenantikörpern möglich. Eine Bestätigung des Verdachts auf Anti-Proteasomenantikörper in der IIF durch spezifische Immunoassays ist in Analogie zu den anderen bekannten Auto-Antikörpern sinnvoll. Somit wird durch die hier gelieferten Erkenntnisse, die eine Detektion von Anti-Proteasomenantikörpern im Screeningverfahren der ANA- Diagnostik beschreiben, die Einbeziehung des hochinteressanten Autoimmunphänomens Anti-Proteasomenantikörper in die diagnostische Routine ermöglicht. Hierdurch können in Zukunft effektiver weitere Daten zur Prävalenz, diagnostischen Wertigkeit und Bedeutung dieser Antikörper bei Autoimmunerkrankungen gewonnen werden.

Autoantibodies against various proteasomal subunits have been detected in sera of patients with different autoimmune diseases, particularly in patients with SLE, dermatomyositis and primary Sjögren syndrome. In order to characterize the specificity of these antibodies in further detail, we isolated the IgG fraction from sera of autoantibody-positive patients with SLE and autoimmune myositis and prepared the anti-proteasome antibodies using an affinity purification techniques. Methods: Isolated antibodies were used to stain proteasome populations on HeLa, SAOS-2 and HEp-2 cells by indiret immune flourescence. The patterns have been compared with fluorescence patterns of monoclonal (mouse) and polyclonal (rabbit) anti-proteasome antibodies. Moreover, the influence of the purified antibodies on proteasomal activity was analysed using fluorogenic peptide substrates. Results: The isolated anti- proteasomal antibodies revealed a fine speckled nuclear pattern sparing the nucleoli. While the cytolasmatic pattern on HeLa- and SAOS-2 cells was rather unspecific, a fine filamentous cytoplasmatic staining was identified on HEp-2-cells. Double stains with the mono- and polyclonal anti-proteasome antibodies confirmed a co-localization of the cognate autoantigen. Interestingly, a co-localisation with AMA positive patient sera was detectable for the cytoplasmatic staining. The calculated amount of the anti-proteasome antibodies in the overall IgG-content of four sera analyzed was approximately 0.3% to 1.3%, of all antibodies, respectively. The isolated anti-proteasomal antibodies derived from patient sera could not inhibit the function of native proteasome in-vitro. Conclusions: The proteasome stains revealed a characteristic and reproducible but not disease specific ANA as well as cytoplasmatic pattern on HEp-2 cells. Although in patients´ sera the proteasome pattern can be superimposed by other autoantibodies, frequently the pattern can be recognized already in routine diagnostics and serves as another autoantibody-autoantigen system identifiable by indirect immune fluorescence.