Wachstumsfaktor-induzierte Stabilisierung des chondrogenen Potentials der humanen Chondrozyten in vitro: (Mögliche Anwendung für das Tissue-Engineering)

Abstract

Im Rahmen der modernen gelenktherapeutischen Forschung, steht seit einigen Jahren eine neue viel versprechende Methode, die autologe Chondrozyten Transplantation (ACT), zur Verfügung. Aus einem gesunden Knorpelareal werden Proben entnommen, die Chondrozyten isoliert und in vitro vermehrt. Ist eine ausreichende Zellzahl vorhanden, werden die Chondrozyten in den bestehenden Knorpeldefekt transplantiert und mit einem Periostlappen gedeckt. Die ACT weist jedoch einige Beschränkungen und Probleme auf. Die Anwendung bleibt derzeit auf kleinere, oberflächliche Knorpeldefekte beschränkt. Außerdem kommt es zur Dedifferenzierung der Chondrozyten während der Proliferationsphase in der Monolayer-Kultur (ML) in vitro. Diese dedifferenzierten Zellen sind nicht fähig, den Knorpeldefekt suffizient und lang anhaltend zu füllen. Ziel dieser Arbeit war es daher, nach Möglichkeiten zur Gewinnung von vitalem Knorpelmaterial zu suchen, um das Verfahren der ACT zu verbessern. Von Wachstumsfaktoren ist bekannt, dass sie anabole Wirkungen auf das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben der Chondrozyten aufweisen. Aus diesem Grund wurden die Effekte von IGF-I und TGF-b1 auf das chondrogene Potential und somit auf das Redifferenzierungsverhalten der Chondrozyten in vitro untersucht. Die Wachstumsfaktoren wurden einzeln oder in Kombination miteinander verwendet. Zusätzlich zu den Untersuchungen in ML wurde der Einfluss von IGF-I und TGF-b1 auf das Redifferenzierungspotential der Zellen in einem 3D Kultursystem untersucht. Die Ergebnisse mit IGF-I und TGF-b1 in dieser Arbeit konnten auf morphologischer Ebene zeigen, dass beide Wachstumsfaktoren in der Lage waren den chondrogenen Phänotyp der Zellen aufrechtzuerhalten. Die Synthese wichtiger knorpelspezifischer Proteine, wie Kollagen Typ II, Proteoglykane und chondrogener Transkriptionsfaktor Sox9 konnte durch die Behandlung mit IGF-I oder/und TGF-b1 stimuliert werden. Zusätzlich ergaben sich additive Effekte auf die Expression der oben genannten Proteine. Um das Redifferenzierungsverhalten der Zellen aus der ML Kultur in 3D zu untersuchen, wurden die Zellen aus der ML Kultur in Massenkultur überführt und hier für weitere sieben Tage kultiviert. Hier zeigte sich, dass IL-1b-stimulierte Zellen nicht fähig waren zu redifferenzieren. Im Gegensatz dazu führte die Behandlung mit Wachstumsfaktoren zur Redifferenzierung der Chondrozyten in Massenkultur sowohl morphologisch als auch auf Proteinebene. Das höchste Redifferenzierungspotential wiesen Chondrozyten nach der kombinierten Behandlung mit beiden Wachstumsfaktoren auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Wachstumsfaktoren (vor allem in Kombination) die Zytokin-induzierten Effekte hemmen und die Chondrozyten in die Lage versetzen in 3D zu redifferenzieren. Auf diesem Weg sind sie fähig die Differenzierung der Chondrozyten zu stabilisieren. Durch die Aufrechterhaltung des chondrogenen Potentials besteht demnach die Möglichkeit, vitale Chondrozyten für die ACT zu gewinnen und somit die Therapie von Knorpelverletzungen zu verbessern.

Concerning cartilage defect repair the autologous chondrocyte transplantation (ACT) plays a central role. Therfore samples are taken from a healthy part of the joint, cells are isolated and expanded in monolayer culture in vitro. When a sufficient number of chondrocytes is obtained, cells are transferred into the cartilage defect and covered with a periostal flap. Although results obtained until now are quite encouraging, the main limitation for successful ACT is often the poor integration of the newly formed cartilage tissue. This is mainly due to the expansion phase in monolayer culture where chondrocytes gradually lose their specific phenotype, dedifferentiate into fibroblast-like cells and thus lose their chondrogenic potential. These dedifferentiating processes lead to chondrocytes that are incapable of initiating cartilage defect repair, resulting in fibrous cartilage tissue. For this reason, new and improved in vitro strategies need to be investigated. Growth factors are known to exert anabolic effects on chondrocytes in vivo and in vitro by influencing chondrocyte proliferation, differentiation, growth and survival. In this work we wanted to examine the influence of IGF-I and TGF-b1 on restoring the chondrogenic potential of IL-1b-treated dedifferentiated chondrocytes from monolayer culture. Growth factors were used separately or in combination. To further investigate the redifferention potential of the cells in 3D culture, cells were transferred in high-density culture and cultured for further seven days. Our results demonstrated, that growth factors were able to restore the chondrogenic phenotype. Furthermore, the synthesis of chondrocyte specific proteins like collagen type II or proteoglycanes and the chondrogenic transcription factor Sox9 was stimulated by IGF-I and TGF-b1. Additive effects on the above mentioned proteins could be observed. To investigate the redifferentiation potential of chondrocytes from monolayer culture, cells were transferred into high-density culture. IL-1b-treated chondrocytes from monolayer were inable to redifferentiate in 3D. In contrast, growth factor treatment resulted in redifferentiation on morphological as well as on protein level. The highest redifferentiation potential was obtained after combined treatment with both growth factors. In conclusion, growth factors (especially combined treatment) are able to inhibit the cytokine-induced effects on chondrocytes. Treatment with growth factors results in stimulation of redifferentiation in 3D culture and therefore stabilisation of the differentiated phenotype. By restoring the chondrogenic potential it is possible to improve the results of ACT.