Porphyromonas Gingivalis suppresses differentiation and increases apoptosis of osteoblasts from New Zealand Obese Mice

Abstract

Background: The metabolic syndrome (metS), a complex cluster of risk factors for chronic diseases such as cardiovascular disease, is observed to be increasingly associated with periodontal disease. Inflammation induced by periodontal pathogens contribute to the inflammatory processes in patients with MetS. However, the fundamental contribution of periodontal bacteria to periodontal bone loss in MetS patients remains unclear. The aim of the present study is to analyze the effect of Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) on differentiation of primary osteoblasts from New Zealand Obese (NZO) mice, a model for MetS, compared to C57BL/6J osteoblasts. Methods: Primary calvarial osteoblasts, isolated from 3-day-old NZO and control C57BL/6J mice, were stimulated with P. gingivalis. Proliferation was quantified by BrdU incorporation. The cell cycle as well as early and late apoptosis were measured by flow cytometry. Gene expression was determined by Real-Time PCR. Results: 12 hours following P. gingivalis stimulation, NZO osteoblasts showed a significantly decreased proliferation (p ≤ 0.01) with increased G2 cell cycle phase compared to normal osteoblasts. Compared to control cells, flow cytometry analysis demonstrated significant (p ≤ 0.01) increase of early apoptotic cells by Annexin-V positive and late apoptosis by Caspase-3 activity in NZOs at 3, and 6 hours following stimulation. No significant LDH release was found following P. gingivalis stimulation. RT-PCR data showed a significantly suppressed expression (p ≤ 0.01) of Collagen 1, Osteocalcin and Runt related transcription factor 2 (Runx2) in NZOs compared to normal osteoblasts. Conclusion: The present data demonstrates that P. gingivalis down-regulates proliferation and promotes apoptosis in primary NZO osteoblasts, unlike C57BL/6J osteoblasts. Also, a suppressed osteoblastic marker expression in NZOs may contribute to pathogenesis of periodontitis in patients with metS. These findings indicate a cellular effect of oral bacterial infections on osteoblast differentiation in a MetS model comprising all metabolic factors. Therefore, the present data may provide a cellular link between both disease entities.

Hintergrund und Zielstellung: Das metabolische Syndrom (metS), ein komplexes Krankheitsbild verschiedener chronischer Erkrankungen, wird häufig im Zusammenhang mit parodontalen Erkrankungen beobachtet. Bei zunehmender Prävalenz von Adipositas sowie assoziierten metabolischen Erkrankungen und deren Folgeerkrankungen ist die Untersuchung des Zusammenhanges von parodontalen Infektionen und metabolischer Dysfunktion und dessen Auswirkung auf das Knochengewebe daher von besonderer Relevanz. Ziel dieser Studie war es, den Einfluss von Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) auf die Differenzierung primärer Osteoblasten der New Zealand Obese (NZO) Maus, ein Model für das metS, zu untersuchen. Methoden: Primäre Osteoblasten wurden aus Kalvarien drei Tage alter NZO Mäuse und C57BL/6J Kontrollmäuse gewonnen. Nach der Kultivierung und unter Nutzung der ersten und zweiten Passagen wurden die Zellen mit P. gingivalis infiziert. Die Zellproliferation wurde mittels BrdU Inkorporation untersucht. Analysen des Zellzyklus sowie der frühen und späten Apoptose wurden mittels Durchflusszytometrie (FACS) durchgeführt. Die Zellnekrose wurde über die freigesetzte Lactatdehydrogenase (LDH)-Konzentration ermittelt. Die Genexpression wurde mit Real-Time-PCR (RT- PCR) analysiert. Ergebnisse: 12 Stunden nach P. gingivalis-Stimulation konnte bei den NZO Osteoblasten im Vergleich zu normalen Osteoblasten (C57BL/6J) eine signifikant verminderte Proliferation (p ≤ 0.01) zusammen mit einer erhöhten G2 Zellzyklusphase beobachtet werden. 3 und 6 Stunden nach der Stimulation, zeigten die NZO Osteoblasten in der durchflusszytometrischen Analyse eine signifikante Steigerung (p ≤ 0.01) der früh (Annexin-V-positiv) und spät (erhöhte Caspase-3-Aktivität) apoptotischen Zellen. Es wurden keine signifikanten Unterschiede in der LDH-Freisetzung festgestellt. Die RT-PCR Daten zeigten eine signifikant unterdrückte Expression (p ≤ 0.01) von Kollagen 1, Osteocalcin und Runt related Transkriptionsfaktor 2 (Runx2) in NZOs im Vergleich zu normalen Osteoblasten. Fazit: Im Vergleich zu normalen Osteoblasten verminderte P. gingivalis die Proliferation in den NZO Osteoblasten und führte gleichzeitig zu einer verstärkten Apoptose. Auch die unterdrückte Expression von Osteoblastenmarkern bei den NZOs kann zur Pathogenese der Parodontitis bei Patienten mit metS beitragen.