Expressionsanalyse viraler Fusionsproteine sowie Studien zur Infektion mit rekombinanten Genomen des porcinen Circovirus

Abstract

Die Porcinen Circoviren Typ1 (PCV1) und Typ2 (PCV2) gehören zur Familie der Circoviridae. Sie gelten in Bezug auf die Xenotransplantation als potenzielle Gefahr für den humanen Empfänger. Zunächst erfolgte die Expression von Fusionsproteinen der beiden größten offenen Leserahmen, die für die Replikationsproteine Rep und Rep` sowie das Kapsidprotein Cap kodieren. Die Expression des vollständigen Kapsidproteins von PCV1 und PCV2 mittels des Expressionsvektors pGEX als GST-Fusionsprotein war nicht möglich, da ein Volllängenprodukt nicht nachweisbar war. Die Variation der Expressions- temperatur, der Zusammensetzung des Nährmediums sowie der Einsatz Protease- defizienter Bakterienstämme brachte keine Verbesserungen. Als mögliche Ursache wurde die Codonzusammensetzung des cap-Gens in Betracht gezogen, die für die Synthese in E.coli ungünstig ist. Durch computergestützte Berechnungen wurde der Codongebrauch optimiert. Die Expression der modifizierten Fusionsproteine ergab Produkte der Größe von ca. 42 kDa für PCV1 sowie der Größe 45 kDa für PCV2, die mit den unlöslichen Zellfraktionen erhalten wurden. Die exprimierten Cap-Proteine stellten die Grundlage zur Synthese von Cap-spezifischer Antikörper dar. Durch Herstellung von Fusionsproteinen mit Fluoreszenzproteinen EGFP bzw. pDsRed konnte die subzelluläre Lokalisation des Kapsidproteins von PCV1 sowie PCV2, als auch der Replikationsproteine von PCV1 einzeln und in Kombination gezeigt werden. Das Kapsidprotein von PCV1 und von PCV2 war in den Nukleoli lokalisiert, es zeigte sich keine Abhängigkeit der Lokalisierung von den Replikationsproteinen. Die Produkte des rep-Gens Rep sowie Rep` akkumulieren im Nukleus, wobei die Nukleoli ausgespart wurden. Die subzelluläre Lokalisation änderte sich bei Kotransfektion von Rep und Cap nicht, demzufolge scheint eine gegenseitige Beeinflussung der Lokalisation nicht wahrscheinlich. Die Kernloklisation wird durch nukleäre Lokalisationssignale (NLS) vermittelt, die in sich anschließenden Studien eingegrenzt wurden (Finsterbusch et al., 2005). Es wurden weiterhin zwei rekombinante Viren hergestellt, die jeweils am 3’-Ende des rep- bzw. des cap- Gens ein EGFP-Gen tragen. Nach Transfektion mit dem rekombinanten Virus pRVC2, welches das an das cap-Gen fusionierte EGFP Protein enthielt, wurde Fluoreszenz beobachtet. Das Fusionsprotein war in den ersten 24 h nach Transfektion im Bereich der Nukleoli lokalisiert, danach kam es zur Verteilung im gesamten Nukleus. Eine produktive Infektion von Zellkulturzellen wurde mit dem rekombinanten Virus RVC2 nicht beobachtet. Vermutlich ist das Fusionsprotein nicht in der Lage die natürlichen Funktionen des Kapsidproteins zu übernehmen. Nach Transfektion des rekombinanten Virus PRVR2, welches das an das rep-Gen fusionierte EGFP-Protein trug, wurde weder Fluoreszenz noch eine Infektion nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass Manipulationen am Rep- Protein von PCV1 schlechter kompensiert werden können.

The porcine circovirus type 1 (PCV1) and type 2 (PCV2) belong to the family of Circoviridae. They are regarded as a potential danger for the human recipient in the context of Xenotransplantation. The present thesis evaluated: 1\. The expression of fusion proteins of the two largest open reading frames of PCV. 2\. The construction of fluorescent fusion proteins 3\. The construction of two recombinant circovirus type 1 isolates carrying the gene of green fluorescent protein fused at the 3’ end of cap or rep. The expression of full capsid protein of PCV1 and PCV2 using the pGEX expression vector system was possible. Variation of the expression temperature, the composition of the culture medium and the use of protease-deficient bacterial strains brought no improvement. The codon preference of the cap gene was considered as a possible cause. Therefore the codon preference was analysed by computer calculation and optimised regions were fused and expressed with the pGEX-expression system. The subcellular localization of the capsid protein and replication proteins Rep / Rep’ were analyzed by the construction of fusion proteins with fluorescent proteins EGFP or pDsRed. Cap of PCV1 and PCV2 were localized in the nucleoli and showed no dependence of the localization of the replication proteins Rep / Rep’. The products of the rep gene Rep / Rep’ accumulated in the nucleus. Cotransfection showed no change in the localization. A reciprocal influence of the localization was not considered likely. Two recombinant viruses, which carry an EGFP gene in each case at the 3 ' ends of the rep or the cap gene were constructed furthermore. After transfection with the recombinant virus PRVC2, which contained the EGFP gene fused to the cap gene, fluorescence was observed. The fusion protein was located in the first 24 h after transfection in the nucleoli. Later, distribution throughout the nucleus was seen. A productive infection of tissue culture cells with the recombinant virus RVC2 was not observed. Presumably, the fusion protein is incapable to take over of the natural functions of the capsid protein. After transfection of the recombinant virus PRVR2, which contained the EGFP gene fused to the rep gene neither fluorescent nor infection was observed what points to the fact that manipulations in the Rep protein can be worse compensated by PCV1.