dc.contributor.author
Caliskan, Rifat
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:19:02Z
dc.date.available
2009-04-16T12:59:31.962Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5971
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10170
dc.description.abstract
Die Porcinen Circoviren Typ1 (PCV1) und Typ2 (PCV2) gehören zur Familie der
Circoviridae. Sie gelten in Bezug auf die Xenotransplantation als potenzielle
Gefahr für den humanen Empfänger. Zunächst erfolgte die Expression von
Fusionsproteinen der beiden größten offenen Leserahmen, die für die
Replikationsproteine Rep und Rep` sowie das Kapsidprotein Cap kodieren. Die
Expression des vollständigen Kapsidproteins von PCV1 und PCV2 mittels des
Expressionsvektors pGEX als GST-Fusionsprotein war nicht möglich, da ein
Volllängenprodukt nicht nachweisbar war. Die Variation der Expressions-
temperatur, der Zusammensetzung des Nährmediums sowie der Einsatz Protease-
defizienter Bakterienstämme brachte keine Verbesserungen. Als mögliche Ursache
wurde die Codonzusammensetzung des cap-Gens in Betracht gezogen, die für die
Synthese in E.coli ungünstig ist. Durch computergestützte Berechnungen wurde
der Codongebrauch optimiert. Die Expression der modifizierten Fusionsproteine
ergab Produkte der Größe von ca. 42 kDa für PCV1 sowie der Größe 45 kDa für
PCV2, die mit den unlöslichen Zellfraktionen erhalten wurden. Die exprimierten
Cap-Proteine stellten die Grundlage zur Synthese von Cap-spezifischer
Antikörper dar. Durch Herstellung von Fusionsproteinen mit
Fluoreszenzproteinen EGFP bzw. pDsRed konnte die subzelluläre Lokalisation des
Kapsidproteins von PCV1 sowie PCV2, als auch der Replikationsproteine von PCV1
einzeln und in Kombination gezeigt werden. Das Kapsidprotein von PCV1 und von
PCV2 war in den Nukleoli lokalisiert, es zeigte sich keine Abhängigkeit der
Lokalisierung von den Replikationsproteinen. Die Produkte des rep-Gens Rep
sowie Rep` akkumulieren im Nukleus, wobei die Nukleoli ausgespart wurden. Die
subzelluläre Lokalisation änderte sich bei Kotransfektion von Rep und Cap
nicht, demzufolge scheint eine gegenseitige Beeinflussung der Lokalisation
nicht wahrscheinlich. Die Kernloklisation wird durch nukleäre
Lokalisationssignale (NLS) vermittelt, die in sich anschließenden Studien
eingegrenzt wurden (Finsterbusch et al., 2005). Es wurden weiterhin zwei
rekombinante Viren hergestellt, die jeweils am 3’-Ende des rep- bzw. des cap-
Gens ein EGFP-Gen tragen. Nach Transfektion mit dem rekombinanten Virus pRVC2,
welches das an das cap-Gen fusionierte EGFP Protein enthielt, wurde
Fluoreszenz beobachtet. Das Fusionsprotein war in den ersten 24 h nach
Transfektion im Bereich der Nukleoli lokalisiert, danach kam es zur Verteilung
im gesamten Nukleus. Eine produktive Infektion von Zellkulturzellen wurde mit
dem rekombinanten Virus RVC2 nicht beobachtet. Vermutlich ist das
Fusionsprotein nicht in der Lage die natürlichen Funktionen des Kapsidproteins
zu übernehmen. Nach Transfektion des rekombinanten Virus PRVR2, welches das an
das rep-Gen fusionierte EGFP-Protein trug, wurde weder Fluoreszenz noch eine
Infektion nachgewiesen, was darauf hindeutet, dass Manipulationen am Rep-
Protein von PCV1 schlechter kompensiert werden können.
de
dc.description.abstract
The porcine circovirus type 1 (PCV1) and type 2 (PCV2) belong to the family of
Circoviridae. They are regarded as a potential danger for the human recipient
in the context of Xenotransplantation. The present thesis evaluated: 1\. The
expression of fusion proteins of the two largest open reading frames of PCV.
2\. The construction of fluorescent fusion proteins 3\. The construction of
two recombinant circovirus type 1 isolates carrying the gene of green
fluorescent protein fused at the 3’ end of cap or rep. The expression of full
capsid protein of PCV1 and PCV2 using the pGEX expression vector system was
possible. Variation of the expression temperature, the composition of the
culture medium and the use of protease-deficient bacterial strains brought no
improvement. The codon preference of the cap gene was considered as a possible
cause. Therefore the codon preference was analysed by computer calculation and
optimised regions were fused and expressed with the pGEX-expression system.
The subcellular localization of the capsid protein and replication proteins
Rep / Rep’ were analyzed by the construction of fusion proteins with
fluorescent proteins EGFP or pDsRed. Cap of PCV1 and PCV2 were localized in
the nucleoli and showed no dependence of the localization of the replication
proteins Rep / Rep’. The products of the rep gene Rep / Rep’ accumulated in
the nucleus. Cotransfection showed no change in the localization. A reciprocal
influence of the localization was not considered likely. Two recombinant
viruses, which carry an EGFP gene in each case at the 3 ' ends of the rep or
the cap gene were constructed furthermore. After transfection with the
recombinant virus PRVC2, which contained the EGFP gene fused to the cap gene,
fluorescence was observed. The fusion protein was located in the first 24 h
after transfection in the nucleoli. Later, distribution throughout the nucleus
was seen. A productive infection of tissue culture cells with the recombinant
virus RVC2 was not observed. Presumably, the fusion protein is incapable to
take over of the natural functions of the capsid protein. After transfection
of the recombinant virus PRVR2, which contained the EGFP gene fused to the rep
gene neither fluorescent nor infection was observed what points to the fact
that manipulations in the Rep protein can be worse compensated by PCV1.
en
dc.format.extent
110 Bl.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Expressionsanalyse viraler Fusionsproteine sowie Studien zur Infektion mit
rekombinanten Genomen des porcinen Circovirus
dc.contributor.contact
rifat-caliskan@gmx.de
dc.contributor.firstReferee
PD Dr. C. Tschöpe
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. H. Zeichhardt
dc.date.accepted
2009-02-03
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000008701-2
dc.title.translated
Analysis of expression of viral fusion proteins und infection studies with
recombinant porcine circovirus
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000008701
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000011375
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access