Impact of proteasome regulator of 28 kDa (PA28) during coxsackievirus B3 infection

Abstract

Introduction During viral infection, proteasomes are essential for maintaining protein homeostasis and increased peptide supply in the context of MHC class I-restricted antigen presentation. Thereby, virus-induced pro-inflammatory cytokines, especially IFNg, induce the expression ofthe regulatory complexes PA28a/β, which accelerate overall proteasomal turnover. Furthermore, such cytokines initiate formation of special proteasome isoforms, immunoproteasomes (IPs), which were reported to be crucial for preserving coxsackievirus B3 (CVB3)-induced myocardial damage. This study investigates the still unknown biological function of PA28α/β complexes in context of CVB3-induced cardiac inflammation. Methods Association of PA28α/β to the different proteasome core complexes was investigated byseparating protein lysates of primary bone- marrow-derived macrophages (BMMs) expressing either mostly IPs or standard proteasomes (SPs) using native PAGE technique. The role of PA28α/β during poly(I:C)-induced cytotoxicity was studied in wild-type and PA28α/β-/- BMMs. Furthermore, coxsackieviral replication was investigated in murine embryonic cardiomyocytes and in HeLa cells either in the presence or absence of PA28α/β. For studying modulatory capacities of PA28α/β in the context of MHC class I ligand generation, epitope-harbouring CVB3 peptides were degraded in vitro by SPs and IPs in the presence of PA28α/β complexes. Finally, to elucidate the impact of PA28α/β during cardiac inflammation in vivo, PA28α/β-deficient mice and their wild-type littermates were challenged with cardiotropic strain of CVB3 Nancy. Results This study showed for the first time that PA28α/β associate with both, SP and IP core complexes with similar efficacy, forming PA28-20S-PA28 and PA700-20S-PA28 proteasome complexes. In vitro experiments mimicking viral infection by direct stimulation of TLR-3 pathway revealed that PA28α/β is involved in preventing accumulation of poly-ubiquitinated proteins but is irrelevant for cell viability and metabolic function. Furthermore, PA28α/β not only facilitates proteasomal generation of CVB3-derived MHC class I epitopes, but it also influences the abundance of both, intracellular coxackieviral RNA and capsid protein. Although general course of virus-induced disease, regarding weight loss, cardiac damage, andmyocardial viral load was not affected in CVB3-infected PA28α/β-deficient mice, abundance of PA28β subunits was significantly increased in heart tissue of wild type animals. Discussion Although PA28α/β has the capability to supress intracellular viral components during CVB3 infection in vitro and facilitates the processing of the certain CVB3-derived MHC class I epitopes, those features were shown to be dispensable during CVB3-induced cardiac inflammation in C57BL/6 mice. In summary, PA28α/β complexes modulate CVB3-inection in vitro, but have no major biological relevance in vivo.

Einführung Während einer Virusinfektion spielen Proteasomen eine wesentliche Rolle bei der Aufrechterhaltung der Proteinhomöostase und bei der gesteigerten Peptidgenerierung im Rahmen der MHC-Klasse I-vermittelten Antigenpräsentation. Dabei induzieren die proinflammatorische Zytokine, insbesondere IFNg, die Expression von PA28α/β-Komplexen, die den gesamten proteasomalen Umsatz beschleunigen. Außerdem initiieren solche Zytokine die Bildung von alternativen Proteasom-Isoformen, den sogenannten Immunoproteasomen (IPs), die für die Erhaltung von Coxsackievirus B3 (CVB3)-induzierten Myokardschäden entscheidend sind. Daher untersucht diese Studie diebiologische Relevanz von PA28α/β-Komplexen im Kontext einer virusinduzierten Herzmuskelentzündung. Methoden Die Assoziation von PA28α/β mit verschiedenen Proteasom-Kernkomplexen wurde mittels native PAGE in Proteinlysaten primärer Knochenmark-Makrophagen (BMMs) nachgewiesen, die im Wesentlichen entweder IPs oder Standard- Proteasomen (SPs) exprimiert hatten. Die Rolle der PA28α/β während der Poly(I:C)-induzierten Zytotoxizität wurde in PA28α/β-/- oder Wildtyp BMMs untersucht. Weiterhin wurde die CVB3-Replikation in Abhängigkeit vonPA28α/β-Komplexen in murinen primären embryonalen Kardiomyozyten und in HeLa-Zellen untersucht. Für die Untersuchung der modulatorischen Wirkung von PA28α/β bei der MHC-Klasse-I-Ligandenerzeugung wurden Epitop-tragende CVB3-Peptide in vitro durch SPs und IPs in Gegenwart von PA28α/β-Komplexen prozessiert. Um die Wirkung von PA28α/β während der Herzentzündung in vivo zu untersuchen, wurden Mäuse, denen die PA28α/β-Expression fehlte, und ihre Wildtyp-Wurfgeschwister mit einem kardiotropen CVB3 Nancy Stamm infiziert. Ergebnisse In dieser Studie wurde erstmals gezeigt, dass PA28α/β in gleichem Maße mit IP- oder SP- Kernkomplexe assoziiert, wodurch PA28-20S-PA28- und PA700-20S-PA28-Proteasom- Komplexen entstehen. In-vitro-Experimente, die die Virusinfektion durch direkte Stimulation der TLR-3-Rezeptoren nachahmen, zeigten, dass PA28α/β zwar die Akkumulation von poly-ubiquitinierten Proteinen verhindert, aber für das Überleben und die metabolische Funktion der Zelle irrelevant ist. Des Weiteren hat PA28α/β nicht nur die Fähigkeit intrazelluläre virale RNA und Proteine während der CVB3-Infektion in vitro zu beeinflussen, sondern erhöht auch die Produktion von CVB3-abgeleiteten MHC- Klasse-I-Epitopen durch das Proteasom. Obwohl der Krankheitsverlauf hinsichtlich Gewichtsverlust, Herzmuskelschädigung und myokardialer Viruslast in CVB3-infizierten PA28α/β-defizienten Mäusen unverändert blieb, waren PA28β- Untereinheiten im Herzgewebe von Wildtyp-Tieren signifikant erhöht Diskussion Obwohl PA28α/β die Fähigkeit hat, intrazelluläre virale Komponenten während der CVB3-Infektion in vitro zu unterdrücken und die Verarbeitung von CVB3-abgeleiteten MHC-Klasse-I-Epitopen erleichtert wird, war dies für die Charakteristika der CVB3-induzierten Herzentzündung in C57BL/6 Mäusen irrelevant. Zusammenfassend besitzt PA28α/β während der CVB3-Infektion in vitro bestimmte Funktionen, diese sind aber in vivo ohne bedeutende biologische Relevanz.