Untersuchung der Funktion der Palmitoylierung von SNAP-25: Eine biochemisch-molecularbiologische Charakterisierung und Aufklärung des toxischen Prinzips

Abstract

Die synaptosomalen SNARE-Proteine VAMP2, Syntaxin1 und SNAP-25 bilden einen SNARE-Komplex, der die Fusion synaptischer Vesikel mit der präsynaptischen Plasmamembran auslöst. Die Bildung und die enzymatische Spaltung des SNARE- Komplexes wurden weitestgehend mit rekombinanten, aus E.coli gereinigten Proteinen untersucht. Jedoch fehlen diesen Proteinen die Proteinmodifikationen, die für eukaryotische Zellen beschrieben sind. Eine wichtige Modifikation der SNARE-Proteine ist die kovalente Bindung von Fettsäuren an SNAP-25. Palmitoylierung findet in einem Kluster von vier Cysteinen statt und ist vermutlich der Anker des intrinsisch hydrophilen Proteins mit der präsynaptischen Plasmamembran. In der vorliegenden Arbeit sind SNAP-25 Wildtyp und Mutanten mit sowohl Substitutionen gegen Serin oder Alanin als auch einer Deletion über einen Bereich von 13 Aminosäuren in der Palmitoylierungsregion als rekombinante Proteine mit Hexahistidinresten in Insektenzellen mit dem Baculovirus-System exprimiert worden. Die SNAP-25 Proteine konnten bis zur offensichtlichen Homogenität in einem einzigen Reinigungsschritt über Nickelaffinitätschromatographie aufgereinigt werden. Es wurde mittels metabolischen Einbaus von 3H-Palmitinsäure dargestellt, dass SNAP-25 in Insektenzellen tatsächlich palmitoyliert wird und auch die Mutanten mit Doppelsubstitutionen der Cysteine noch 20-30% palmitoyliert vorliegen. Das beweist, dass beide Cysteinpaare direkt oder indirekt an der Palmitoylierung beteiligt und für eine vollständige Palmitoylierung notwendig sind. Durch Phasentrennung mit Triton X-114 konnte ein Anstieg des Hydrophobizitätsanteils von SNAP-25 durch Palmitoylierung auf 30% beobachtet werden. Im Gegensatz dazu befindet sich nicht acyliertes SNAP-25 ausschließlich in der wässrigen Phase. Dieser Hydrophobizitätsanstieg zeigt, dass ein signifikanter Anteil der SNAP-25 Moleküle palmitoyliert sein muss. Überraschenderweise zeigten sich große Oligomere von palmitoyliertem und nicht palmitoyliertem SNAP-25 im Elektronenmikroskop. Oligomere des palmitoyliertem sind wesentlich stabiler als die des nicht palmitoyliertem SNAP-25. Sie können außerdem unter nicht reduzierenden Bedingungen durch SDS-PAGE und unter reduzierenden, aber nicht- denaturierenden Bedingungen in Zweidimensionaler Gelelektrophorese detektiert werden. Die Oligomere konnten nach einem weiteren Reinigungsschritt mit Anionenaustauscher-chromatographie nicht mehr beobachtet werden. Es bleibt also unklar, ob die SNAP-25-Oligomere eine Eigenschaft von palmitoyliertem SNAP-25 sind oder durch eine im Coomassie-Gel nicht sichtbare Verunreinigung ausgelöst werden können. Aus Insektenzellen gereinigtes SNAP-25 bindet an die anderen neuronalen SNARE-Proteine Syntaxin1 und VAMP2. Der Palmitoylierungsgrad hat keinen bedeutenden Einfluss auf die SNARE-Komplex- Bildung. Der ternäre SNARE-Komplex mit palmitoyliertem SNAP-25 aus Insektenzellen besitzt die gleichen Eigenschaften wie der Komplex mit nicht palmitoyliertem SNAP-25. Er ist resistent gegen Behandlung mit SDS und lässt sich durch NSF und alpha-SNAP in Gegenwart von Adenosintriphosphat enzymatisch dissoziieren. Die Palmitoylierung von SNAP-25 hat eine Auswirkung auf die Bindung an künstliche Membranen. Während palmitoyliertes SNAP-25 zu 75% in Liposomen eingebaut werden kann, ist dies mit nicht palmitoyliertem nur zu einem geringen Prozentsatz (11%) möglich. Dieses Ergebnis unterstützt die postulierte Membranankerfunktion der Fettsäuren.

The synaptosomal SNARE-proteins VAMP2, Syntaxin1 and SNAP-25 form a SNARE- complex which triggers fusion of synaptic vesicles with the presynaptic plasma membrane. Assembly and disassembly of the SNARE-complex has been extensively studied in vitro with recombinant proteins purified from E.coli. However, those proteins lack the authentic protein modifications described for eukaryotic cells. One important modification of SNARE-proteins is the covalent attachment of fatty acids to SNAP-25. Palmitoylation occurs on a cluster of four cysteines and is thought to anchor this intrinsically hydrophilic protein to the presynaptic plasmam membrane. In this thesis SNAP-25, the wild-type protein as well as mutants with substitutions and deletions in the palmitolyation domain, were expressed as His-tagged constructs with the baculovirus system in insect cells. SNAP-25 proteins could be purified to apparent homogenity with a single Ni-affinity chromatography step. Metabolic labeling with 3H-palmitic acid showed that SNAP-25 purified from insect cells is indeed palmitoylated. SNAP-25 mutants with substitutions of two cysteines are palmitoylated to 20-30% relative to the wild-type protein. This proved that both cysteine pairs are directly or indirectly involved in palmitoylation. In Triton X-114 phase separation experiments palmitoylated SNAP-25 molecules were recovered to 30% from the hydrophobic detergent phase. In contrast, non-acylated SNAP-25 is present exclusively in the hydrophilic phase. This increase in the hydrophobicity suggests that a significant amount of all SNAP-25 molecules are palmitoylated. Surprinsingly, large oligomers of palmitoylated and non-acylated SNAP-25 are visible by electron microscopy. Oligomers of palmitoylated SNAP-25 are more stable compared to non-acylated SNAP-25. They were also detected by SDS-PAGE under non-reducing conditions and by reducing, but non-denaturing 2D-gel-electropheris. They were not present after a further purification step with anion exchange chromatography. Therefore it remains unclear whether oligomer formation is an intrinsic property of SNAP-25 or is induced by contaminating molecules undetectable in a coomassie stained gel. SNAP-25 purified from insect cells binds to the other neuronal SNARE-proteins Syntaxin1 and VAMP2. Palmitoylation of SNAP-25 has no significant effect on SNARE-complex formation. The ternary SNARE-complex with palmitoylated SNAP-25 from insect cells has the same properties as the complex with non-acylated SNAP-25. It is resistant to SDS treatment and can be disassembled by NSF and alpha-SNAP in the presence of ATP. Palmitoylation influences binding of SNAP-25 to artificial membranes. Palmitoylated SNAP25 can be reconstituted to 75% in liposomes, whereas only a small percentage (11%) of non-palmitoylated SNAP-25 molecules could be recovered from the liposome fraction. This result supports the postulated membrane anchor function of the fatty acids.