Aufklärung der Funktion von Serotonin in β-Zellen des Pankreas: die Serotonylierung kleiner GTPasen moduliert die Insulinsekretion

Abstract

Diabetes mellitus ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, deren Prävalenz mit bedenklicher Geschwin­digkeit zunimmt. Obwohl die Krankheit Gegenstand zahlloser Studien ist und viele Tiermodelle für die verschiedenen Diabetestypen generiert wurden, um die Ätiologie dieser Krankheit aufzuklären, sind einige ihrer Aspekte immer noch nicht vollständig verstanden. Dazu gehört die rätselhafte Funktion von Serotonin (5‑HT) in den pankreatischen β‑Zellen, dessen Kolokalisation mit Insulin in den β‑Granula der Inselzellen seit über 30 Jahren bekannt ist und sogar häufig zur indirekten Quantifizierung der Insulinsekretion genutzt wird. Nichts­destotrotz konnte das Vorkommen von 5‑HT in β‑Zellen bislang mechanistisch nicht erklärt werden. Zur Klärung der Funktion von 5‑HT in β‑Zellen wurden transgene Mäuse untersucht, bei denen das für die Tryptophan-Hydroxylase 1 codierende Gen inaktiviert ist (Tph1‑/‑). Deren periphere Gewebe enthalten infolge dessen kein 5‑HT, während die neuronalen 5‑HT‑Spiegel unverändert sind. Die Tph1‑/‑ Mäuse haben einen gestörten Metabolismus, der sich durch Hyperphagie, eine veränderte Insulinsekretion, und Diabetes mellitus manifestiert. Durch Glucosetoleranztests mit gleichzeitiger Bestimmung der Glucose- und Insulinspiegel wurde eine Insulinsekretionsdefizienz der β‑Zellen von 5‑HT‑defizienten Mäusen aufgedeckt, was den Diabetes unter Berücksichtigung seiner Vererblichkeit und des frühen Krankheitsbeginns bereits zwei Wochen nach der Geburt als juvenilen Erwachsenendiabetes (MODY) klassi­fiziert. Wurden jedoch die peripheren 5‑HT‑Spiegel mit seiner Vorläufersubstanz 5‑Hydroxy­tryptophan rekonstituiert, konnte der diabetische Phänotyp vollständig aufgehoben werden. Wie die eingehende Untersuchung der zu Grunde liegenden Mechanismen an Insulinoma­zellen ergab, wird 5‑HT von Transglutaminasen kovalent an die kleinen GTPasen Rab3a und Rab27a gekoppelt, die dadurch konstitutiv aktiviert werden und die Insulinsekretion verstärken. Dieser rezeptorunabhängige Signalmechanismus wurde von uns kürzlich in Thrombocyten entdeckt und Serotonylierung genannt. Serotonyliertes Rab3a wird verstärkt ubiquitinyliert und proteasomal abgebaut, was im Einklang zur bekannten Inaktivierung anderer serotonylierter GTPasen steht. Wie die Ergebnisse zeigen, ist intrazelluläres 5‑HT ein positiver Modulator der Insulinsekretion und die Serotonylierung von Rab3a und Rab27a dient ihrer Feinregulation. Aus den vorgestellten Ergebnissen lassen sich neue pharma­kologische Möglichkeiten zur therapeutischen Beeinflussung der Insulinsekretion ableiten, die im Detail diskutiert werden. Darüber hinaus ist es sehr wahrscheinlich, dass 5‑HT auch in weiteren physiologischen Zusammenhängen über eine Serotonylierung von Signalproteinen wirkt, zusätzlich zu seiner bekannten rezeptorvermittelten Signalwirkung. Interessanterweise ist die Lebenserwartung von Tph1‑/‑ Tieren trotz ihres Diabetes normal und sie zeigen keine der typischen Diabetes-assoziierten kardiovaskulären Sekundär­schäden. Deren Auftreten wird vermutlich durch die in der Literatur beschriebene verringerte primäre Hämo­stase der Tph1‑/‑ Tiere verhindert. Um den potenziellen therapeutischen Nutzen einer Reduktion peripherer 5‑HT‑Spiegel von Diabetespatienten unter­suchen zu können, wurde ein induzierbares Mausmodell für Typ-1 Diabetes mellitus (T1DM) generiert. Das Modell basiert auf der spezifischen Expression der Nitroreduktase aus E. coli in den β‑Zellen der Tiere, die das ungiftige Protoxin CB1954 zu einem potenten Cytotoxin umsetzt und damit die β‑Zellablation und einen T1DM auslöst. Die Wirksamkeit dieses Modells wurde in Insulinomazellen und transgenen Tieren bestätigt, die den erwarteten induzierbaren T1DM zeigen. Anhand dieses Tiermodells kann künftig die Auswirkung einer peripheren 5‑HT‑Depletion auf die Sekundärschäden von T1DM untersucht werden, wobei die 5‑HT-Spiegel pharmakologisch oder durch Kreuzung mit den Tph1‑/‑ Mäusen verringert werden können.

Diabetes is a life-threatening disease with a prevalence that is increasing at an alarming rate. It is extensively investigated and a considerable number of animal models were generated to shed light on the aetiology of this disease. However, many regulatory aspects of insulin secretion are still poorly understood. One unanswered question concerns the enigmatic role of serotonin (5‑HT) in β‑cells, although its co-localization with insulin in β-granules of pancreatic islets was demonstrated more than three decades ago and, moreover, it is often used as a surrogate measure for insulin secretion. Nevertheless, the physiological role of 5‑HT in β‑cells remains unclear. To elucidate the function of 5‑HT in β‑cells, transgenic mice that lack the gene coding for tryptophan hydroxylase 1 (Tph1‑/‑) and therefore also lack 5‑HT in the periphery, while brain levels of 5‑HT are normal, were investigated. Tph1‑/‑ mice show metabolic abnormalities defined by hyperphagia, altered insulin secretion, and diabetes mellitus. Glucose tolerance tests with simultaneous detection of glucose and insulin identified a primary defect in insulin secretion of the β‑cells of 5‑HT-deficient mice. This defect together with its heritable pattern and the early onset already two weeks after birth classifies the diabetes as maturity-onset diabetes of the young (MODY). The replenishment of peripheral 5‑HT by application of its direct precursor 5-hydroxytryptophan completely rescued this phenotype. In elucidating the underlying mechanism in insulinoma cells, it is demonstrated that serotonin is transamidated to the small GTPases Rab3a and Rab27a by transglutaminases during insulin exocytosis, which renders them constitutively active, in a receptor-independent signalling mechanism we have recently identified in thrombocytes and have termed ‘serotonylation’. It is also shown that serotonylated Rab3a is subjected to enhanced proteasomal degradation, which is in line with the known inactivation of other serotonylated GTPases. Taken together, this study identifies intracellular 5‑HT as a positive modulator of insulin secretion, which is finely regulated by the serotonylation of Rab3a and Rab27a. New pharmacological possibilities in diabetes therapy resulting from the presented data will be discussed in detail. Moreover, our results suggest that serotonin is likely to function in various physiological contexts via serotonylation in concert with the known receptor-mediated signalling. Interestingly, despite of their diabetes mellitus, Tph1‑/‑ mice live as long as their wild type littermates and do not suffer from cardiovascular secondary damages typically associated with diabetes. The known reduced primary haemostasis of Tph1‑/‑ mice most likely prevents these complications. To study the possible therapeutic benefit of reduced peripheral 5‑HT levels for diabetes patients, an inducible mouse model for type 1 diabetes mellitus (T1DM) was generated. This model is based on the expression of E. coli nitroreductase specifically in β‑cells of the mice, which converts the non-toxic prodrug CB1954 into a potent cytotoxin thereby ablating the β‑cells and inducing T1DM. The function of this model was verified in insulinoma cells and transgenic animals that show the expected inducible T1DM. This model should allow to investigate the consequences of 5‑HT depletion on the development of secondary damages in T1DM either by pharmacological depletion or by crossing of the T1DM mice to Tph1‑/‑ mice.