Targeting amyloidogenic immunoglobulin light chain aggregates with small molecules

Abstract

The deposition of amyloid fibrils has long been implicated as a pathological hallmark of immunoglobulin light chain amyloidosis (AL). In this devastating disease monoclonal plasma cell clones in the bone marrow overproduce immunoglobulin light chain proteins which form aggregates in the blood stream ultimately leading to the systemic infiltration of organs and tissues. The heart and the kidney are the two most affected organs. Cardiac involvement represents over 50% of all cases where the wall of the heart is heavily enlarged due to the immense load of amyloid deposition which causes cardiac arrhythmia and finally death. Current treatment is predominantly based in destroying the underlying B-cell clone using chemotherapy which is often too aggressive for the debilitated patients. Consequently, new therapeutic strategies are utterly needed. One promising approach is to target the amyloid deposition with small molecules. Targeting amyloid deposits requires the isolation of the latter from the affected organ. In this study, light chain aggregates were prepared from the heart of a patient with AL amyloidosis and were systematically characterized in terms of β-sheet content, size, SDS- stability and morphology. The results obtained from this study represent the first detailed biochemical and biophysical characterization of light chain aggregates isolated from the heart of a patient with AL amyloidosis. For purification, the water-extraction method established by Pras and coworkers was applied. Water-extracted material was analyzed by biochemical and biophysical methods. Thioflavin T (ThT) and Congo red (CR) assays showed that patient-derived light chain aggregates have a high β-sheet content. Results from the analysis by filter retardation assays (FRAs) and blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) indicate that patient-derived light chain aggregates contain high molecular weight lambda light chain structures. Furthermore, SDS-PAGE followed by Western blotting revealed that patient-derived light chain aggregates are non-SDS-stable structures. In addition, electron microscopy (EM) suggests that patient-derived light chain aggregates are fibrillar as well as amorphous in structure. Moreover, the investigation of patient-derived-light chain aggregates with the MTT assay showed reduced cell viability of HeLa cells, indicating a cytotoxic effect. The preparation of patient-derived light chain aggregates enables the evaluation of the targetability of patient-derived light chain aggregates in order to identify small molecules with a potential to remodel light chain aggregates which is another focus of this study. In order to identify potent modulators against purified patient-derived light chain aggregates a small molecule screening was performed. Therefore, a ThT-based fluorescence assay was developed. Using this assay the drug apomorphine was identified to be most effective in reducing the β-sheet content of patient-derived light chain aggregates. The effect of apomorphine was further characterized using a set of biochemical and biophysical techniques (CR assays, FRAs and 8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid (ANS) assays). These assays indicated that apomorphine may remodel the biochemical properties of heart-derived light chain aggregates and potentially affects their β-sheet content, SDS-stability, size, surface hydrophobicity and morphology. Furthermore, MTT assays provided experimental evidence that the metabolic activity of HeLa cells exposed to light chain aggregates could be rescued in presence of apomorphine, suggesting a rescuing effect of mitochondrial dysfunction. In addition, the aggregation of a light chain protein was studied using the recombinant full-length light chain protein AL01 produced in E. coli and derived from a patient with excessive cardiac involvement. To this end, a ThT-based fluorescence assay was established for monitoring light chain AL01 aggregation. Recombinant light chain aggregates were further analyzed using a set of biochemical and biophysical techniques. The full-length light chain protein AL01 formed β-sheet rich, high molecular weight, SDS-soluble, amorphous aggregates in vitro. Subsequent studies with small molecules and preformed light chain aggregates showed that apomorphine is not only effective in remodeling patient-derived light chain aggregates but remodels also in vitro generated light chain aggregates. Taken together, the preparation and characterization of patient-derived light chain aggregates enables the identification of novel agents opening up new routes for developing effective therapeutic strategies to combat AL amyloidosis.

Die Leichtketten (AL) Amyloidose ist durch die Ablagerung von extrazellulären Amyloidfibrillen im Gewebe charakterisiert. Kranke Plasmazellen im Rückenmark sind dafür verantwortlich, dass Leichtketten-Proteine überproduziert werden, die im Blut aggregieren und zur systemischen Infiltration von Organen und Geweben mit Leichtketten-Aggregaten führt. Das Herz und die Niere sind dabei am häufigsten betroffen. In über 50% der Fälle ist das Herz so stark infiltriert, dass es zu einer massiven Verdickung der Herzwände führt, was eine Herzinsuffizienz zur Folge hat. Die Behandlung der AL Amyloidose basiert auf der Zerstörung der verantwortlichen Plasmazellen mittels Chemotherapie, um die Vermehrung des Amyloids zu reduzieren. Diese Therapie stellt jedoch eine sehr aggressive Art dar, die für die instabilen Patienten nur schwierig zu tolerieren ist. Es gibt keine Therapie, die AL Amyloidose heilen kann. Daher werden dringend neue Therapie-Strategien gebraucht. Ein vielversprechender Ansatz ist das Amyloid mit kleinen Molekülen anzugreifen. Um dies zu realisieren, ist es notwendig, die pathogenen Leichtketten-Aggregate aus Patienten zu isolieren. Dazu wurden in dieser Arbeit Leichtketten-Aggregate aus dem Herzen eines Amyloidose-Patienten mittels Wasser-Extraktionsmethode aufgereinigt und systematisch charakterisiert. Die aus der vorliegenden Arbeit generierten Ergebnisse repräsentieren die erste detaillierte Studie, in der Leichtketten-Aggregate aus dem Herzen eines AL Amyloidose Patienten präpariert und sowohl biochemisch als auch biophysikalische charakterisiert wurden. Thioflavin T (ThT)- und Congo Rot (CR)-basierte Fluoreszenzassays zeigten, dass die präparierten Leichtketten-Aggregate aus β-Faltblatt-reichen Strukturen bestehen. Mittels Filtertests und Blau nativer Polyacrylamid- Gelelektrophorese (BN-PAGE) konnte gezeigt werden, dass diese Aggregate hochmolekulare lambda Leichtketten-Proteinkomplexe sind. Die Analysen mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blot ergaben, dass die Leichtketten-Aggregate unter denaturierenden Bedingungen nicht stabil sind. Desweiteren wurde mittels Elektronenmikroskopie (EM) gezeigt, dass Leichtkettenaggregate sowohl fibrilläre also auch amorphe Strukturen bilden. Untersuchungen an HeLa-Zellen ergaben, dass die Behandlung mit den isolierten Leichtketten-Aggregaten zu einer signifikanten Reduktion der metabolischen Aktivität der Zellen führte, was auf einen potentiell cytotoxischen Effekt hinweist. Der zweite Fokus dieser Arbeit liegt darin, die präparierten Aggregate einer Wirkstofftestung zu unterziehen. Um wirksame Modulatoren zu identifizieren wurden die isolierten Leichtketten-Aggregate mit kleinen Molekülen behandelt und mittels ThT Assays analysiert. Dabei wurde Apomorphin als dasjenige Molekül identifiziert, das den β-Faltblatt-Anteil der Aggregate am effektivsten reduzierte. Weiterhin wurde der Effekt von Apomorphin mittels verschiedener biochemischen und biophysikalischen Methoden im Detail charakterisiert. Es konnte eine zeitaufgelöste Veränderung im β -Faltblatt-Anteil und in der SDS-Stabilität der Leichtketten-Aggregate gezeigt werden. Desweitern deuten die Ergebnisse darauf hin, dass sich die Größe, die Oberflächenhydrophobizität und die Morphologie der Leichtketten-Aggregate in Gegenwart von Apomorphin verändern. Außerdem weisen Toxizitätsassays in HeLa- Zellen darauf hin, dass die durch die Leichtketten-Aggregate induzierte Reduzierung der metabolischen Aktivität durch Apomorphin möglicherweise aufgehoben wird. Damit konnte gezeigt werden, dass ein Wirkstoff-Screening gegen Leichtketten-Aggregaten aus Patientenmaterial eine mögliche Strategie darstellt, um neue potente Wirkstoffe zu identifizieren. Darüber hinaus wurde die Aggregation des Volllängen-Leichtketten Proteins AL01 analysiert. Die Leichtketten Aggregate wurden mittels biochemischen und biophysikalischen Methoden charakterisiert. Die daraus resultierenden Ergebnisse zeigten, dass das Leichtketten-Protein AL01 β-Faltblatt-reiche, hochmolekulare Strukturen ausbilden, die SDS-löslich und amorph in der Struktur sind. Um den Effekt von Apomorphin auf Patienten-Aggregate zu bestätigen, wurden zusätzlich die rekombianten Leichtketten-Aggregate mit Apomorphin getestet. Dabei deuten die Resultate darauf hin, dass Apomorphin nicht nur Aggregate aus Patientenmaterial sondern auch in vitro generierte Leichtketten-Aggregate modellieren kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass im Zuge dieser Arbeit Leichtketten-Aggregate aus dem Herzen eines AL Amyloidose Patienten isoliert und charakterisiert werden konnten. Durch ein direktes Wirkstoff-Screening konnte ein potentieller Modulator gegen pathogene Leichtketten-Aggregate identifiziert werden und stellt damit einen wichtigen neuen Ansatzpunkt für weiterführende Studien dar.