The importance of the ribosomal elongation factor 4 (LepA)

Abstract

EF4 (LepA) is a recently detected elongation factor in bacteria, which has the unique function of back-translocating ribosomes from the post-translocated state and thus catalyzes just the opposite reaction of the translocase EF-G. EF 4 is widely distributed – practically present in all bacteria, mitochondria and chloroplasts – and highly conserved; therefore it is astonishing that a knock-out of its gene lepA has no phenotype. Since EF4 increases the active fraction of the synthesized proteins in vitro, it was speculated that it might improve the accuracy, perhaps simply via retardation of protein synthesis. Here we demonstrate that the underlying assumption mentioned above is incorrect. Furthermore, we present in vivo and in vitro data that for the first time can explain the importance of this factor: 1: In rich medium under non-stress conditions EF4 is present only in trace-amounts in the cytoplasm, but in larger quantities in the membrane fraction. Under stress conditions the ratio membrane-cytoplasm is changed dramatically: Most of the factor is now in the cytoplasm and minor amounts are in the membrane saying that the membrane is a storage organ for this factor. 2: Growth competition experiments show that under non-stress conditions the absence or presence of EF4 in the cell hardly makes a difference, but that stress conditions that increase the intracellular ionic strength, cells lacking this factor are overgrown by wild- type cells in a few generations. 3: Antibiotics that affect EF-G functions have been tested also with EF4 (both factors are structurally related). Thiostrepton blocks the uncoupled GTPase from both EF-G and EF4, whereas micrococcin shows a diverse effect: EF-G dependent GTPase is stimulated, whereas that of EF4 is blocked. Fusidic acid binds directly to EF-G and blocks its GTPase and interestingly also that of EF4. 4: EF4 does not affect the accuracy of protein synthesis at any Mg2+ concentration, but surprisingly accelerates the synthesis rate by up to five-fold exclusively under unfavorable ionic conditions. These observations could be reconciled to the following picture of the EF4 importance: For osmoregulation bacteria can change their intracellular ionic strength in a wide range, e.g. the K+ concentration from optimal about 100 mM to 1,000 mM, which affects the structure of ribonucleo-particles such as the ribosome. Unfavourable ionic conditions increase the fraction of stalled ribosomes that block protein synthesis. EF4 is mobilizing these stalled ribosomes and thus overall accelerates protein synthesis. It is known that a ribosome that pauses during protein synthesis within a domain impairs co-translational folding. Therefore it is conceivable that unscheduled stalled ribosomes within a domain also impair the co-translational folding. Mobilization of these ribosomes will improve the active fraction of the co-translational folded protein. In this way EF4 is required under unfavorable ionic conditions and will be provided by the membrane fraction of the cell. It follows that both accelerating protein synthesis and increasing the active protein fraction are consequence of the unique function of EF4, namely back-translocating and mobilizing stalled ribosomes.

EF4 (LepA) ist ein kürzlich entdeckter Elongationsfaktor in Bakterien, der eine einzigartige Funktion ausübt: Er rück-transloziert post-translokationale Ribosomen und katalysiert damit die umgekehrte Reaktion der Translokase EF-G. Seine weite Verbreitung – EF4 kommt praktisch in allen Bakterien, in Mitochondrien und Chloroplasten vor – und hohe Konservierung läßt eine wichtige Funktion vermuten, deshalb ist es eine erstaunlich Tatsache, das ein Knock-out des EF4 Gens keinen ausgeprägten Phänotyp hat. Da es die aktive Fraktion von Proteinen erhöht, vermutete man, daß er die Genauigkeit der Proteinsynthese verbessert, vermutlich einfach über eine Verlangsamung derselben. Hier zeigen wir, daß die oben erwähnte, zugrunde liegende Annahme unrichtig ist. Unsere in vivo und in vitro Ergebnisse können zum ersten mal die Rolle und Bedeutung dieses Faktors erklären: 1: In reichem Medium und abwesenden Streßbedingungen (hohe/niedrige Temperaturen, hohe Salze u.a.) findet sich EF4 nur in geringen Mengen im Zytoplasma, ist aber in größeren Mengen in der Membranfraktion zu finden. Unter Streßbedingungen, die die intrazelluläre Ionenstärke anschwellen lassen, verändert sich die Verteilung dramatisch: Nun ist der größere Anteil des Faktors im Zytoplasma. Offenbar fungiert die Membran als Vorratsorgan für EF4. 2: Wachstumswettbewerb- Experimente zeigen, das bei Abwesenheit von Streß EF4, ob in der Zelle vorhanden oder nicht, nur eine unbedeutende Rolle, wenn überhaupt, spielt. Unter Streßbedingungen jedoch werden die Zellen, denen EF4 fehlt, nach wenigen Generationen von Wild-Typ Zellen überwachsen. 3: Antibiotika, die EF-G Funktionen beeinflussen, wurden auch mit EF4 getestet (EF-G und EF4 habe eine sehr ähnliche Struktur). Thiostrepton blockiert die entkoppelte EF-G abhängige GTPase wie auch die von EF4, während Micrococcin unterschiedlich die Funktion beider Faktoren affiziert: EFG abhängige GTPase wird stimuliert und die von EF4 blockiert. Fusidinsäure bindet an EF-G und blockiert die GTPases, und ebenfalls die von EF4, was mit der fast identischen Bindungstasche von Fusidinsäure erklärt werden kann. 4: EF4 verbessert nicht die Genauigkeit der Proteinsynthese bei allen möglichen Mg2+ Konzentrationen, aber überraschenderweise beschleunigt es die Proteinsynthese bei hohen Mg2+ Konzentrationen bis zu fünffach. Hohe Mg2+ Konzentrationen verlangsamen die Proteinsythese, was auch einen Anstieg der auf einer mRNA blockierten Ribosomen einschließt. Diese Ergebnisse können zu folgendem Bild der Rolle und Bedeutung von EF4 zusammen gesetzt werden: Merkmal der bakteriellen Osmoregulation ist, daß Bakterien die intrazelluläre K+ Konzentration in weiten Grenzen variieren können, von z.B. 100 mM bis auf 1,000 mM, letztere Konzentration verändert stark die Struktur von Ribonukleopartikeln wie die des Ribosoms. Die Folge ist eine verstärktes Stehenbleiben eines Ribosomes auf der mRNA eines Polysoms, was einen totalen Ausfall der Proteinsythese auf dieser mRNA nach sich zieht. EF4 erkennt und mobilisiert diese angehaltenen Ribosomen und beschleunigt so insgesamt die Proteinsynthese einer Zelle. Es ist ferner bekannt, daß ein Pausieren von Ribosomen während der Proteinsynthese inmitten einer Domäne die co-translationale Faltung des Proteins verschlechtert. Deshalb darf man annehmen, daß wenn hohe Ionenstärke die Fraktion der angehaltenen Ribosomen vermehrt, die Verminderung derselben mittels EF4 auch die aktive Fraktion der Proteine vermehrt. Auf diese Wiese ist unter ungünstigen Wachstumsbedingungen EF4 im Cytoplasma erforderlich und wird dazu aus der Membran bereitgestellt. Wir sehen, daß beides – Beschleunigung der Proteinsynthese und Verbesserung der aktiven Fraktion – Folgen der einzigartigen EF4 Funktion sind: Rücktranslokation und Mobilisierung von zufällig angehaltenen Ribosomen unter ungünstigen Ionenbedingungen.