dc.contributor.author
Anders, Marco
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:13:44Z
dc.date.available
2009-09-16T07:32:43.477Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5883
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-10082
dc.description.abstract
Die DNA, Träger der genetischen Information, ist permanent Schädigungen
ausgesetzt. Das humane SNM1B/Apollo-Protein ist in die zelluläre Antwort auf
DNA-Schäden, die durch ionisierende Strahlung (IR) und DNA-
interstrangvernetzende (DIV) Zytostatika verursacht werden, involviert. Wir
konnten zeigen, dass hSNM1B an TRF2 bindet. TRF2 ist eine Komponente des
Shelterin-Komplexes und hat Funktionen beim Aufbau und Schutz der Telomere,
sowie in der frühen Antwort auf röntgenstrahlen-induzierte DNA-Schäden.
Letzteres ist unseren Befunden zur Folge eine Funktion, die hSNM1B und TRF2
wahrscheinlich in Kooperation ausführen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass
endogenes hSNM1B mit TRF1 und TRF2 in Foci kolokalisiert. Zusätzliche Foci
konnten nach IR-Behandlung nachgewiesen werden, die nicht an den Telomeren
lokalisiert waren. Mit Hilfe von „live-cell-imaging“-Experimenten beobachteten
wir die Akkumulation von hSNM1B an photo-induzierten Doppelstrangbrüchen
bereits 10 Sekunden nach Induktion. Als weiteren Beleg für eine Beteiligung an
der frühen DNA-Schadensantwort zeigten hSNM1B-depletierte Zellen nach IR-
Behandlung eine reduzierte Autophosphorylierung von ATM, sowie eine reduzierte
Phosphorylierung von ATM-Zielproteinen. Über Tandem-Affinity-Purification
(TAP) in Kombination mit massenspektrometrischen Analysen konnten wir HSC70,
HSP72, HSP60 und β-Tubulin als potentielle Bindungspartner identifizieren. Die
Bindung zwischen hSNM1B und HSP72 wurde in reziproken Ko-Immunopräzipitationen
bestätigt und die Interaktion von hSNM1B und HSP72 auf die
Substratbindungsdomäne des Hitzeschockproteins eingegrenzt. Induzierte DNA-
Schäden beeinflussten nicht die Interaktion von HSP70 und hSNM1B. Versuche mit
HSP72 depletierten Fibroblasten (siRNA), zeigten eine signifikante Reduktion
von nukleären hSNM1B-Foci. Zudem fanden wir in hSNM1B-depletierten Zellen eine
Reduktion in der Phosphorylierung des ATR-Zielproteins CHK1 als zelluläre
Antwort auf UVC-Bestrahlung. hSNM1B-depletierte Zellen zeigen nach Behandlung
mit IR einen zellulären Phänotyp, der dem von kultivierten Zellen von
Patienten mit Nijmegen-Breakage-Syndrom (NBS) ähnelt. Das NBN-Gen ist bei NBS-
Patienten mutiert und kodiert für das Protein Nibrin, welches an der Reparatur
von DNA-Doppelstrangbrüchen beteiligt ist. In einem Teilprojekt dieser Arbeit
wurde mit Hilfe eines konditionalen Nbn-Maus-Modells untersucht, wie sich die
Expression von Leberproteinen vor und nach der Induktion einer Nbn-
Nullmutation unterscheidet. Verglichen wurden dabei insbesondere Leberproteine
aus Nbn(+/-)- und Nbn(-/-)-Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach IR-
Exposition. Die Auftrennung der Leberproteine erfolgte mittels 2D
Gelelektrophorese, die Identifizierung von Proteinen mit veränderter
Expression erfolgte anschließend über Massenspekrometrie. Insgesamt konnten in
den Lebern aus bestrahlten Mäusen mit homozygoter Nullmutation, 209 Proteine
mit von den Kontrolltieren abweichender Expression identifiziert werden. Nach
ontologischer Zuordnung dieser Proteine zeigte sich, dass die in den Nbn-
Nullmutanten veränderte Genexpression vor allem Proteine betraf, deren
Funktion im Zusammenhang mit oxidativem Stress und der Aufrechthaltung der
zellulären Redox-Homöostase steht.
de
dc.description.abstract
Human SNM1B/Apollo, a member of the SNM1 family of proteins, is involved in
the cellular response to DNA-damage. We have shown that hSNM1B interacts with
TRF2, a protein involved in protecting the telomeres from degradation and DNA
repair. Moreover, we found that in cells in which hSNM1B was depleted by
treatment with siRNA, activation of the ATM kinase after exposure to ionizing
radiation was attenuated. These observations together with the finding that
hSNM1B accumulates at sites of DNA damage within in seconds, suggest an
important role for hSNM1B in the response to IR induced damage. We have used
Tandem-Affinity-Purification in combination with mass spectrometry to identify
additional binding partners of hSNM1B. This revealed HSC70, HSP72, HSP60 and
β-Tubulin to be hSNM1B-interactors. We have confirmed the interaction of
hSNM1B and HSP70 in co-immunoprecipitation assays and found that hSNM1B binds
to a C-terminal fragment of HSP72, known to contain the substrate binding
domain. Depletion of HSP72 in human fibroblasts resulted in a significant
reduction of nuclear hSNM1B foci. We also found the phosphorylation of CHK1 at
serine 317 to be attenuated in response to UVC irradiation as a consequence of
hSNM1B depletion, a result which extends our previous findings on the DNA-
damage response function of hSNM1B.
en
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::610 Medizin und Gesundheit
dc.title
Funktionsanalyse von hSNM1B/Apollo im Netzwerk der frühen zellulären DNA-
Schadensantwort
dc.contributor.contact
marco-anders@web.de
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Martin Digweed
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. L. Wiesmüller
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. M. Löbrich
dc.date.accepted
2009-09-18
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000012461-8
dc.title.translated
Functional analysis of hSNM1B/Apollo in the early cellular DNA damage response
network
en
refubium.affiliation
Charité - Universitätsmedizin Berlin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000012461
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000006239
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access