Funktionsanalyse von hSNM1B/Apollo im Netzwerk der frühen zellulären DNA- Schadensantwort

Abstract

Die DNA, Träger der genetischen Information, ist permanent Schädigungen ausgesetzt. Das humane SNM1B/Apollo-Protein ist in die zelluläre Antwort auf DNA-Schäden, die durch ionisierende Strahlung (IR) und DNA- interstrangvernetzende (DIV) Zytostatika verursacht werden, involviert. Wir konnten zeigen, dass hSNM1B an TRF2 bindet. TRF2 ist eine Komponente des Shelterin-Komplexes und hat Funktionen beim Aufbau und Schutz der Telomere, sowie in der frühen Antwort auf röntgenstrahlen-induzierte DNA-Schäden. Letzteres ist unseren Befunden zur Folge eine Funktion, die hSNM1B und TRF2 wahrscheinlich in Kooperation ausführen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass endogenes hSNM1B mit TRF1 und TRF2 in Foci kolokalisiert. Zusätzliche Foci konnten nach IR-Behandlung nachgewiesen werden, die nicht an den Telomeren lokalisiert waren. Mit Hilfe von „live-cell-imaging“-Experimenten beobachteten wir die Akkumulation von hSNM1B an photo-induzierten Doppelstrangbrüchen bereits 10 Sekunden nach Induktion. Als weiteren Beleg für eine Beteiligung an der frühen DNA-Schadensantwort zeigten hSNM1B-depletierte Zellen nach IR- Behandlung eine reduzierte Autophosphorylierung von ATM, sowie eine reduzierte Phosphorylierung von ATM-Zielproteinen. Über Tandem-Affinity-Purification (TAP) in Kombination mit massenspektrometrischen Analysen konnten wir HSC70, HSP72, HSP60 und β-Tubulin als potentielle Bindungspartner identifizieren. Die Bindung zwischen hSNM1B und HSP72 wurde in reziproken Ko-Immunopräzipitationen bestätigt und die Interaktion von hSNM1B und HSP72 auf die Substratbindungsdomäne des Hitzeschockproteins eingegrenzt. Induzierte DNA- Schäden beeinflussten nicht die Interaktion von HSP70 und hSNM1B. Versuche mit HSP72 depletierten Fibroblasten (siRNA), zeigten eine signifikante Reduktion von nukleären hSNM1B-Foci. Zudem fanden wir in hSNM1B-depletierten Zellen eine Reduktion in der Phosphorylierung des ATR-Zielproteins CHK1 als zelluläre Antwort auf UVC-Bestrahlung. hSNM1B-depletierte Zellen zeigen nach Behandlung mit IR einen zellulären Phänotyp, der dem von kultivierten Zellen von Patienten mit Nijmegen-Breakage-Syndrom (NBS) ähnelt. Das NBN-Gen ist bei NBS- Patienten mutiert und kodiert für das Protein Nibrin, welches an der Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen beteiligt ist. In einem Teilprojekt dieser Arbeit wurde mit Hilfe eines konditionalen Nbn-Maus-Modells untersucht, wie sich die Expression von Leberproteinen vor und nach der Induktion einer Nbn- Nullmutation unterscheidet. Verglichen wurden dabei insbesondere Leberproteine aus Nbn(+/-)- und Nbn(-/-)-Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten nach IR- Exposition. Die Auftrennung der Leberproteine erfolgte mittels 2D Gelelektrophorese, die Identifizierung von Proteinen mit veränderter Expression erfolgte anschließend über Massenspekrometrie. Insgesamt konnten in den Lebern aus bestrahlten Mäusen mit homozygoter Nullmutation, 209 Proteine mit von den Kontrolltieren abweichender Expression identifiziert werden. Nach ontologischer Zuordnung dieser Proteine zeigte sich, dass die in den Nbn- Nullmutanten veränderte Genexpression vor allem Proteine betraf, deren Funktion im Zusammenhang mit oxidativem Stress und der Aufrechthaltung der zellulären Redox-Homöostase steht.

Human SNM1B/Apollo, a member of the SNM1 family of proteins, is involved in the cellular response to DNA-damage. We have shown that hSNM1B interacts with TRF2, a protein involved in protecting the telomeres from degradation and DNA repair. Moreover, we found that in cells in which hSNM1B was depleted by treatment with siRNA, activation of the ATM kinase after exposure to ionizing radiation was attenuated. These observations together with the finding that hSNM1B accumulates at sites of DNA damage within in seconds, suggest an important role for hSNM1B in the response to IR induced damage. We have used Tandem-Affinity-Purification in combination with mass spectrometry to identify additional binding partners of hSNM1B. This revealed HSC70, HSP72, HSP60 and β-Tubulin to be hSNM1B-interactors. We have confirmed the interaction of hSNM1B and HSP70 in co-immunoprecipitation assays and found that hSNM1B binds to a C-terminal fragment of HSP72, known to contain the substrate binding domain. Depletion of HSP72 in human fibroblasts resulted in a significant reduction of nuclear hSNM1B foci. We also found the phosphorylation of CHK1 at serine 317 to be attenuated in response to UVC irradiation as a consequence of hSNM1B depletion, a result which extends our previous findings on the DNA- damage response function of hSNM1B.