Einfluss des Monomers TEGDMA als Bestandteil dentaler Composite auf das COP9 Signalosom und die Differenzierung von LiSa-2 Zellen

Abstract

Dentale Composite sind für die moderne Zahnheilkunde essentiell. Sie dienen nicht nur der direkten und substanzschonenden Füllungstherapie, sondern werden auch als Befestigungsmaterial für indirekte, laborgefertigte Konstruktionen eingesetzt. In der organischen Phase der Composite kommen verschiedenste Monomere zum Einsatz. Das wichtigste Comonomer moderner Composite ist das Triethylenglycoldimethacrylat (TEGDMA), ein Ester aus α,β-Methacrylatsäure und Ethylenglycol. Viele Studien bescheinigen dem Monomer TEGDMA cytotoxische und genotoxische Wirkungen verbunden mit negativen Effekten auf die Vitalität von Zellen und auf die Differenzierung von Fibroblasten der Pulpa. Bisher sind jedoch die genauen Mechanismen der TEGDMA Wirkung unbekannt. Um den Einfluss von TEGDMA auf die Differenzierung von humanen Zellen zu untersuchen, wurden LiSa-2 Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von TEGDMA inkubiert. LiSa-2 Präadipozyten sind ein anerkanntes und gut charakterisiertes Modellsystem für Untersuchungen der Differenzierung von Adipozyten, die Adipogenese. Dieser Prozess ist durch eine Vielzahl von regulatorischen Proteinen kontrolliert, deren Stabilität durch das Ubiquitin- Proteasom-System (UPS) bestimmt wird. Eine Komponente des UPS, das COP9 Signalosom (CSN), ist für die Adipogenese entscheidend. Das CSN bindet an Cullin- RING-Ubiquitin-Ligasen (CRL) und reguliert deren Aktivität. Die CRL ubiquitinieren wichtige Regulatoren der Adipogenese, wie p27 und CHOP, was zum Abbau durch das 26S Proteasom führt. In der vorliegenden Arbeit sollten folgende Fragen beantwortet werden: Wie wirkt sich die TEGDMA Behandlung von LiSa-2 Zellen auf das CSN, auf Komponenten der CRL wie Cul1 und Cul3 und auf die Substrate p27 und p53 aus? Wie wird die Differenzierung von LiSa-2 Präadipozyten durch TEGDMA beeinflusst? Gibt es einen Effekt von TEGDMA auf die Apoptose von LiSa-2 Zellen? Was ist der Mechanismus der TEGDMA Wirkung in LiSa-2 Zellen? Die Ergebnisse zeigen eine reduzierende Wirkung von TEGDMA auf die Untereinheiten des CSN und auf einige CSN-assoziierte Proteine. In Abhängigkeit von der TEGDMA Konzentration wurde eine Verlangsamung der Adipogenese in LiSa-2 Zellen beobachtet. Bei hohen TEGDMA Konzentrationen wurde eine verstärkte Apoptose in LiSa-2 Zellen gemessen und die Vitalität der Zellen nahm drastisch ab. Interessanterweise konnte die durch TEGDMA hervorgerufene gesunkene Vitalität der Zellen durch den Einsatz von N-Acetylcystein (NAC), einem Antioxidants, signifikant verbessert werden. Ob die Senkung der CSN Untereinheiten in Anwesenheit von TEGDMA auf den Anstieg von Reactive Oxygen Species (ROS) zurückzuführen ist, muss in der Zukunft weiter untersucht werden. Als Schlussfolgerung für die Zahnheilkunde ergibt sich, dass die Konzentration des TEGDMA Monomers durch optimale Polimerisationsraten möglichst gering gehalten werden muss. Ob NAC als Schutz gegen verbleibende TEGDMA Monomere eingesetzt werden kann, bedarf weiterer Forschungen.

Dental Composites are essential for current dentistry. They serve not only as direct and substance-protecting filling material, but are also used as fixation material for indirect, labor-made construction. The organic phase of composites contains different monomers. The most important monomer of current composites is the triethylenglycolmethacrylat (TEGDMA), an ester composed of α,β-methacrylat acid and ethylenglycol. Many studies evidenced cytotoxic and genotoxic properties of the TEGDMA monomer connected with negative effect on cell vitality and on the differentiation of fibroblast pulp cells. At the moment the exact mechanisms of TEGDMA action are unknown. To study the influence of TEGDMA on differentiation of human cells LiSa-2 cells were treated with different concentrations of TEGDMA. LiSa-2 preadipocytes are a recognized and well-characterized model system for the investigation of adipocyte differentiation called adipogenesis. This process is controlled by a large number of regulatory proteins, the stability of which is determined by the ubiquitin proteasome system (UPS). One component of the UPS, the COP9 signalosome (CSN), is essential for adipogenesis. The CSN binds to cullin- RING-ubiquitin ligases (CRLs) and regulates their activity. CRLs ubiquitinate important regulators of adipogenesis, such as p27 and CHOP, and target them for proteolysis by the 26S proteasome. In the present study the following questions were answered: How does TEGDMA treatment of LiSa-2 cells influence the CSN, components of CRLs such as Cul1 and Cul3 and the substrates p27 and p53? How does TEGDMA influence the differentiation of LiSa-2 preadipocytes? Is there an effect of TEGDMA on the apoptosis in LiSa-2 cells? What is the mechanism of TEGDMA action in LiSa-2 cells? The data shows that TEGDMA treatment leads to a reduction of CSN subunits and of CSN-associated proteins. In dependence on the TEGDMA concentration a retardation of adipogenesis in LiSa-2 cells was observed. At high TEGDMA concentrations an increase apoptosis rate in LiSa-2 cells was measured and cell vitality drastically decreased. Interestingly, the decreased cell vitality induced by TEGDMA treatment was significantly rescued by using the antioxidant N-acetylcystein (NAC). Whether the reduction of CSN subunits in the presence of TEGDMA is due to the elevation of reactive oxygen species (ROS) has to be studied in the future. As a consequence for dentistry we conclude that the TEGDMA monomer has to be kept low by optimized polymerization rate. Whether NAC can be used as protection against remaining TEGDMA monomers, needs additional research.