Claudin-Peptide zur Modulation der tight junction-Dichtheit

Abstract

Epitheliale und endotheliale Zellen bilden pharmakologische Barrieren in vielen Teilen des Organismus. Zum Beispiel wird das periphere Nervensystem durch das Perineurium und das zentrale Nervensystem durch die Blut- Hirnschranke gegenüber den meisten hydrophilen Wirkstoffen abgeschirmt. Diese Barrieren erschweren dadurch die Therapie z.B. von neurodegenerativen Erkrankungen oder eine spezifische Schmerzbehandlung im Perineurium. Bisherige Strategien zur verbesserten Wirkstoffzuführung basieren auf der unspezifischen Öffnung von Zellbarrieren mit zum Teil molaren Dosierungen, sind durch hohe Risiken und Nebenwirkungen und eingeschränkte Effizienz gekennzeichnet oder benötigen aufwändige galenische Modifikationen. Klinische Anwendungen sind deshalb bisher sehr begrenzt. Maßgebend für die parazelluläre Barriereabdichtung sind bestimmte Claudin (Cld)-Subtypen. Diese Transmembranproteine dichten mit ihren extrazellulären Schleifen (EZS) den parazellulären Spalt ab und begrenzen damit die Stoffdiffusion zwischen den Zellen. Die Kombination der Cld-Subtypen ist gewebespezifisch. Ihre Modulation durch EZS-Peptidomimetika stellt daher eine vielversprechende Strategie dar, um die Durchlässigkeit einer Barriere spezifisch und sicher zu erhöhen. Zur Modulation von Cld-Interaktionen für die parazelluläre Öffnung wurden Peptidomimetika der EZS1 und -2 von Cld1 bis -5 hergestellt und ihre molekularen, strukturellen und Bindungseigenschaften untersucht. Schwerpunkt der Arbeit war das Cld1-Peptid mC1C2. Es führte in Zellkulturbarrieren mit unterschiedlicher Cld-Ausstattung zur Umverteilung von Cld1-5 von der Zellmembran ins Zytosol und dadurch zur Beeinträchtigung der Barrierefunktion. mC1C2 internalisierte in Minuten, interagierte direkt mit Cld1 und -5 und indirekt mit Cld2-4, modulierte die Cld-Strangstruktur und erhöhte ab 6 h konzentrationsabhängig und reversibel die Permeation hydrophiler, ansonsten nicht barrieregängiger Substanzen. Diese Befunde bestätigten sich in vivo: mC1C2 führte durch Cld1-Bindung und über den Transkriptionsfaktor Cdx2 zur Cld1-Downregulation im Cld1-dominierten Perineurium. Es kam zur zeit-, dosisabhängigen, nebenwirkungsfreien Öffnung für hydrophile, nicht- perineuriumgängige Wirkstoffe für bis zu 48 h. Mit Struktur-/Funktionsuntersuchungen wurden die mC1C2-Wirkregion ermittelt, optimierte Derivate hergestellt und die Peptidaktivität auf ein β-Faltblatt, das von einer α-Helix flankiert wird, eingeengt. Auf dieser Grundlage wurde ein Modell zur Interaktion zwischen mC1C2 und Cld1 entwickelt. Insgesamt wird das Verständnis über die molekulare Struktur, Funktion und Regulation von Claudinen als Barrierebildner und als Ziel für pharmakologische Interventionen erweitert und die peptidbasierte Permeationsverstärkung als eine aussichtsreiche Strategie für die spezifische, transiente, nebenwirkungsfreie Öffnung von Zellbarrieren identifiziert.

Epithelial and endothelial cells constitute pharmacological barriers in organs such as the perineurium and the blood-brain barrier, which efficiently limit the delivery of hydrophilic drugs into the peripheral and central nervous system, respectively. As a consequence, specific treatment of pain via the perineurium or therapy of e.g. neurodegenerative diseases is hampered. Current strategies to improve drug penetration include unspecific opening of cell barriers using high doses, produce side-effects or need specific drug formulation which limits their clinical application. The paracellular tightening is mediated by specific claudin (Cld) subtypes. The extracellular loops (ECL) of these transmembrane proteins close the paracellular gap against uncontrolled diffusion. As different barriers show tissue specific Cld subtype patterns, their modulation is a promising strategy to improve drug release and to enable safe and reliable drug access through cell barriers. Aimed at paracellular opening, peptidomimetics derived from ECL1 and -2 of Cld1-5 were developed to modulate Cld interactions. Focusing on the Cld1 peptide mC1C2, their molecular, structural and binding properties were examined. In cell culture models exerting different Cld compositions, mC1C2 application led to a redistribution of Cld1 to -5 from the plasma membrane to the cytosol, thereby compromising the barrier tightness. mC1C2 was internalized within minutes, it interacted directly with Cld1 and -5 and indirectly with Cld2-4. mC1C2 modulated the Cld strand morphology and, starting 6 h after administration, reversibly increased the permeability for hydrophilic, usually barrier- impermeable molecules in a concentration dependent manner. These findings were confirmed in vivo in the Cld1-dominated perineurium, where mC1C2 induced Cld1 down-regulation by binding to Cld1 and suppressing the transcription factor Cdx2. For up to 48 h, a time- and dose depended opening of the perineurium was observed for hydrophilic compounds being perineurium-impermeable under normal conditions. Using a structure-/function approach, the active region of mC1C2 was elucidated, an optimized derivative was developed and the activity of mC1C2 was attributed to a β-sheet, flanked by an α-helix. These results provided the basis for the development of a model describing the spatial interaction of mC1C2 and Cld1. The knowledge about the molecular structure, function and regulation of claudins is extended in the light of their barrier- forming properties and as a target for pharmacological intervention. Furthermore, the data indicate that a peptide-based strategy to enhance drug permeation is promising to specifically, transiently and safely open cellular barriers for drug delivery.