Die Rolle des Wilmstumorproteins WT1 bei der Entwicklung der neuronalen Retina

Abstract

Das Wilmstumorgen WT1 kodiert einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor und wurde ursprünglich aufgrund seiner durch Mutationen bedingten Inaktivierung bei 10-15% sporadischer Nierentumoren bei Kindern (Wilmstumoren, Nephroblastome) identifiziert. Neben seiner Bedeutung als Tumorsuppressor ist WT1 auch für die normale Entwicklung des Urogenitalsystems und epithelialer Gewebe mesodermalen Ursprungs erforderlich. Die Expression von WT1 in neuroektodermalen Geweben und die Assoziation von Wilmstumoren mit Fehlbildungen des Auges (Aniridie) warfen die Frage auf, ob WT1 auch für die Entwicklung neuronaler Zellen der Retina bedeutsam sein könnte. Mausembryonen mit homozygoter Inaktivierung des Wt1 Gens hatten im Vergleich zu Wildtypmäusen zellärmere Retinae mit einem Verlust von ca. 40% der retinalen Ganglienzellen und ein gestörtes Sehnervenwachstum. Das Fehlen retinaler Ganglienzellen war bedingt durch eine Proliferationsstörung neuronaler Progenitorzellen in einer frühen Phase der Embryonalentwicklung (E12) und durch Apoptose von Ganglienzellvorläufern in späteren Stadien (E18). Der retinale Phänotyp Wt1-defizienter Mäuse ähnelte der Retinamorphologie von Mäusen mit homozygoter Inaktivierung des POU-Domänen Transkriptionsfaktors Pou4f2. Pou4f2 ist für die terminale Differenzierung und das Überleben retinaler Ganglienzellen erforderlich. Während Wt1 und Pou4f2 in retinalen Ganglienzellen von Wildtypmäusen kolokalisiert waren, fehlte Pou4f2 in den Wt1-defizienten Retinae. Der Verlust der retinalen Pou4f2 Expression und der Retinadefekt bei Wt1-mutierten Embryonen waren durch transgene Expression eines 280 kb humanen WT1 Genkonstrukts partiell kompensierbar. Wt1 war damit für die Expression von Pou4f2 in der embryonalen Retina erforderlich. Stabile Expression der Wt1(-KTS) Isoform, die als Transkriptionsregulator fungiert, in humanen embryonalen Nierenzellen resultierte in einer signifikanten Zunahme von endogenem Pou4f2 Protein und mRNA. In U2OS Osteosarkomzellen mit induzierbarer Wt1(-KTS) Expression wurde ebenfalls eine Korrelation beider Faktoren nachgewiesen. Um den Mechanismus der Regulation von Pou4f2 durch Wt1 weiter zu untersuchen, wurde zunächst ein POU4F2 Promotor-Reporterkonstrukt hergestellt, in dem die 5 regulatorische Region des humanen POU4F2 Gens enthalten war. Bei transienter Kotransfektion in U2OS Zellen aktivierte die Wt1(-KTS) Isoform ein ca. 3,8 kb langes POU4F2 Promotor-Reporterkonstrukt, während die Wt1(+KTS) Spleißvariante, die bei der post-transkriptionellen mRNA Prozessierung beteiligt ist, den POU4F2 Promoter nicht induzierte. Durch sukzessive Verkürzung des Promotor-Reporterkonstrukts wurde der Wt1-responsive Bereich im POU4F2 Promoter eingegrenzt und mittels Sequenzanalyse eine mögliche Wt1 Bindungsstelle identifiziert, die Ähnlichkeit mit einer Wt1 Konsensusstelle in bereits beschriebenen Wt1 Zielgenen hatte. Gezielte Deletion dieser potenziellen Wt1 Bindungsstelle verhinderte die Transaktivierung des POU4F2 Promoters durch Wt1(-KTS). Die Spezifität der Wt1 Bindung an das identifizierte Element wurde durch Elektrophorese Mobilitätsgelshiftassay (EMSA) und Kompetitionsexperimente bestätigt. Anhand dieser Ergebnisse wurde Pou4f2 als ein neues Zielgen von Wt1 charakterisiert.

The Wilms tumor gene WT1 encodes a zinc finger transcription factor and was initially identified by its mutational inactivation in 10-15% of sporadic kidney tumors in children (Wilms tumors, nephroblastomas). In addition to its role as a tumor suppressor WT1 is essential for normal development of the urogenital tract and epithelial tissues derived from the mesoderm. WT1 expression in neural tissues and eye abnormalities (aniridia) in Wilms tumor patients led to the assumption that WT1 may be required for the formation of the embryonic retina as well. Compared to their normal littermates, mouse embryos with targeted deletion of the Wt1 gene had remarkably thinner retinas lacking approx. 40% of the retinal ganglion cells. Furthermore, the growth of the optic nerve was severely disturbed in Wt1-deficient embryos. Loss of ganglion cells in the developing retina was due to impaired proliferation of neural progenitor cells in the early embryonic stage (e12) and increased apoptosis of retinal ganglion cell precursors during the later phases of embryonic development (e18). The retinal phenotype of Wt1-deficient mice was reminiscent of the retinal abnormalities that were seen in mice lacking the POU-domain transcription factor Pou4f2. Pou4f2 is essential for the terminal differentiation and survival of retinal ganglion cells as well as the outgrowth, guidance and fasciculation of their axons. Wt1 and Pou4f2 were co- localized in developing retinal ganglion cells of wild-type mice, and expression of Pou4f2 was lost in Wt1-deficient retinas. The lack of Pou4f2 expression and the defects in Wt1-mutant retinas were partially complemented by transgenic delivery of a yeast artificial chromosome (YAC) containing approx. 280 kb of the human WT1 gene. Pou4f2 protein and mRNA were significantly enhanced in human embryonic kidney cells with stable expression of the Wt1(-KTS) isoform, which functions as a transcriptional regulator. Likewise, U2OS osteosarcoma cells with inducible expression of the Wt1(-KTS) splice variant had increased Pou4f2 levels compared to uninduced cells. These findings suggested that Wt1(-KTS) can stimulate the expression of Pou4f2. To investigate the underlying mechanism a POU4F2 promoter-reporter construct was generated, which contained approx. 3.8 kb of the human POU4F2 promoter sequence. This construct was transiently transfected into U2OS osteosarcoma cells together with Wt1 expression vectors encoding either the Wt1(-KTS) or the Wt1(+KTS) isoform. The Wt1(-KTS) splice variant significantly stimulated transcription from the POU4F2 promoter whereas the Wt1(+KTS) isoform, which is presumably involved in post-transcriptional mRNA processing rather than transcriptional control, had no significant effect. Truncated POU4F2 promoter- reporter constructs were co-transfected to narrow-down the responsible Wt1 sensitive element. Sequence analysis revealed a predicted Wt1 consensus site that was similar to a previously defined high affinity Wt1 binding sequence. Targeted deletion of this element abolished activation of a POU4F2 promoter- reporter construct by Wt1(-KTS). Binding of Wt1(-KTS) to the identified element was demonstrated by electophoresis mobility shift assay (EMSA) and competition experiments. These findings indicate that Pou4f2 is a novel transcriptional downstream target gene of Wt1.