Differentielle Genexpression nach Behandlung mit dem Parathormon-verwandten Protein (PTHrP)

Abstract

Das Parathormon-verwandte Protein (PTHrP) weist teilweise eine Sequenzhomologie zum Parathormon (PTH) auf und wird in verschiedenen Tumorentitäten exprimiert. In dieser Studie sollte mittels subtraktiver Suppressionshybridisierung (SSH) in einem genomweiten Ansatz untersucht werden, ob PTHrP (1–34) die Expression einzelner Gene auf der Ebene der Transkription steigert. Für die experimentellen Untersuchungen wurde eine Zelllinie ausgewählt, von der bekannt war, dass sie sowohl PTHrP als auch den PTH/PTHrP-Rezeptor Typ I (PTH/PTHrP1R) koexprimiert. In Voruntersuchungen war für diese Zelllinie eine autokrine PTHrP-induzierte Regulation von verschiedenen Matrix-abbauenden Enzymen, ohne Veränderungen der mRNA-Spiegel, nachgewiesen worden. Ursprünglich stammt die Zelllinie von einem humanen Nierenzellkarzinom ab, das nach Langzeitpassage auf der Nacktmaus in Zellkultur etabliert wurde. Die hier durchgeführten Untersuchungen mit relevanten Aussagen zur Zellspezies belegen für die eingesetzte Zelllinie nicht wie vermutet das Genom einer humanen Zelllinie, sondern einer Mauszelllinie. Basierend auf Voruntersuchungen wird für die verwendete Zelllinie eine neoplastische Transformation angenommen, die bereits während der Langzeitpassage auf der Nacktmaus erfolgt ist und am ehesten auf eine spontane Mutation im Transplantattumor zurückzuführen ist. Durch die SSH- Technik in eine Richtung (vorwärts) wurden Gene selektiert, die potenziell PTHrP-(1–34)-abhängig hochreguliert wurden. Für zwei Gene wurde ein PTHrP- induzierter mRNA-Anstieg auch im Northern Blot bestätigt. Die Sequenzanalyse dieser Gene ergab eine Homologie zu dem „Rezeptor für aktivierte C-Kinase 1“, Mus musculus receptor for activated C-kinase 1 (RACK1), mRNA und dem „Ubiquitin-konjugierenden Enzym Ubc9“, Mus musculus ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9, mRNA. Der in der vorliegenden Arbeit dokumentierte mRNA-Anstieg von RACK1 und Ubc9 ist als PTHrP-induzierte Wirkung auf der Ebene der Transkription zu deuten, die vermutlich über den PTH/PTHrP1R reguliert wird. Sowohl RACK1 als auch Ubc9 werden in verschiedenen Tumorentitäten vermehrt exprimiert. RACK1 beeinflusst durch Protein-Protein-Interaktion zahlreiche Signalwege und Ubc9 reprimiert überwiegend die Transkription. Funktionelle Eigenschaften, die diese Proteine zusammenhängend im biologischen Kontext mit PTHrP beschreiben, sind nicht bekannt. Die hier nachgewiesene, PTHrP- induzierte Expressionsänderung von RACK1 und von Ubc9 lässt für PTHrP eine bedeutsame Rolle in der Regulation der Signaltransduktion und der Transkription transformierter Zellen vermuten.

Parathyroid hormone-related protein (PTHrP) shares a sequence homology with parathyroid hormone (PTH) and is expressed in various tumour tissues. This study is intended to research by subtractive suppression hybridization (SSH) in a genome-wide setting, whether PTHrP (1-34) raises the expression of individual genes at the level of transcription. For the experiments a cell line was chosen known to co-express both PTHrP and the PTH/PTHrP receptor type I. A autocrine regulation of several matrix-degrading enzymes by PTHrP has been demonstrated previously in this cell line without alterations of the mRNA levels. This cell line is derived from a human renal cell carcinoma, which has been long-term passaged on nude mouse before establishing the cell culture. With relevant statements concerning the cell species, the investigations carried out here back up the fact that the cell line used here not exhibits the genome of a human cell line, but a mouse cell line. Based on preliminary investigations we assume neoplastic transformation for the used cell line, which has already taken place during the long-term passage on the nude mouse and is most likely to be traced back to a spontaneous mutation in the transplant tumour. By means of SSH technique in one direction (forward), genes have been selected, which potentially have been upregulated, depending on PTHrP-(1-34). For two genes, a PTHrP-induced mRNA increase has also been confirmed within the Northern blot technique. The sequence analyse of these genes resulted in homology towards the “receptor for activated C kinase 1”, Mus musculus receptor for activated C kinase 1 (RACK1), mRNA and the “ubiquitin-conjugating enzyme Ubc9”, Mus musculus ubiquitin-conju¬ga¬ting enzyme Ubc9, mRNA. In the present work documented mRNA increase of RACK1 and Ubc9 is to be interpreted as a PTHrP-induced effect at the transcription level, that presumably is regulated via PTH/PTHrP1R. Both RACK1 as well as Ubc9 are expressed to an increased extent in various tumour entities. Through protein-protein-interaction in particular, RACK1 influences many signal paths and Ubc9 predominantly represses the transcription. However, functional characteristics, which describe this protein with PTHrP in connection with the biological context, are not known. The PTHrP-induced expression modification of RACK1 and Ubc9 indicates that PTHrP could adopt an important role in the regulation of signal transduction and the transcription of transformed cells.