A new model of pharmacoresistant seizure like events and age specific effects of antiepileptic drugs

Abstract

Background and purpose: Drug resistance of epilepsy is an important clinical problem that affects around 75% of mesial temporal lobe epilepsies patients. Previously a number of reports have shown that in organotypic hippocampal slice cultures (OHSCs) the in vivo morphology and the basic intrinsic connection are retained. However, some reorganization of axonal connections also occurs which is comparable to that observed in patients with epilepsy and in animal models of temporal lobe epilepsy. It was hypothesized that this reorganization of neuronal networks in OHSCs may provide in vitro models of epilepsy. In this PhD thesis, the suitability of OHSCs as in vitro models of epileptiform activities was explored. Age specific effects of antiepileptic drugs (AEDs) were investigated using acute slices prepared from different age groups of rat. The mechanism of pharmacoresistance in immature rat brain was also investigated. Experimental approach: OHSCs were prepared from 2-12 day old rats. Field potentials (FP) and extracellular potassium concentration ([K+]o) in area CA3 and CA1 were measured. AEDs were tested against seizure like events (SLEs) induced by low magnesium (Mg2+) or 4-aminopyridine (4-AP). The effects of glutamate receptor antagonists, GABAA and GABAB receptor agonists, a GABA uptake blocker, a neurosteroid and taurine on low Mg2+ induced SLEs were also tested. AEDs were also tested against high frequency electrical stimulation (HFS)-induced primary after discharges (PADs) in OHSCs. Acute hippocampal-entorhinal cortex slices were prepared from 3-19 days old rats. FP and the [K+]o were measured in CA3 and medial entorhinal cortex and the effects of AEDs, a NKKC1 blocker and a carbonic anhydrase blocker against 4-AP induced SLEs were studied. Key results: Except neurotoxic dose of phenobarbital (200 µM), all the AEDs were unable to block SLEs induced either by low Mg2+ or 4-AP in OHSCs. The pathophysiological relevance of SLEs in OHSCs was demonstrated by reversible suppression of SLEs by glutamate receptor antagonists, GABAA receptor agonists, a GABA uptake blocker and a neurosteroid. In contrast to low Mg2+ or 4-AP model, HFS-induced PADs in OHSCs were suppressed by the AEDs. In the acute hippocampal-entorhinal cortex slices, SLEs around first postnatal week were more resistant to AEDs as compared to SLEs after second postnatal week. The NKCC1 blocker suppressed SLEs efficiently during the first postnatal week and had no major effects after the second week. The carbonic anhydrase inhibitor has similar age specific effect as other AEDs. Conclusions: It is proposed that OHSCs can be used as either a pharmacoresistant or a pharmacosensitive epilepsy model depending on how seizures are induced. 4-AP induced SLEs in the acute temporal cortex slices showed strong pharmacoresistance only around first postnatal week and the NKCC1 cotransporter most likely contributes to this pharmacoresistance.

Hintergrund und Zielsetzung: Pharmakoresistenz ist u.a. bei etwa 75% aller Patienten mit einer Temporallappenepilepsie zu beobachten und ist damit ein ungelöstes Problem in der klinischen Forschung und Praxis. Ausgangspunkt der vorliegenden Arbeit ist eine Reihe von Veröffentlichungen, die gezeigt haben, dass in organotypischen Kulturen des Hippokampus von Nagetieren die in vivo Morphologie und die grundlegenden intrinsischen Verbindungen erhalten bleiben. Allerdings kommt es zu einer Reorganisation vor allem von axonalen Verbindungen, wie sie auch bei Patienten mit Epilepsie und in Tiermodellen der Temporallappenepilepsie beobachtet werden kann. Die Art der Reorganisation neuronaler Netzwerke in organotypischen Kulturen lässt vermuten, dass hier möglicherweise ein in vitro Modell der Temporallappenepilepsie zur Verfügung stehen könnte. Diese Möglichkeit wurde in der vorliegenden Dissertation untersucht. In einer begleitenden Studie wurde in akuten Schnitten des postnatalen temporalen Kortex die Altersabhängigkeit der Wirkung von Antiepileptika untersucht und es wurden Mechanismen der Pharmakoresistenz epileptiformer Aktivität studiert. Experimenteller Ansatz. Organotypische Kuturen wurden von 2 bis 12 Tage alten Ratten gewonnen. In den Arealen CA1 und CA3 des Hippokampus wurden Feldpotentiale und extrazelluläre Kaliumkonzentrationen gemessen. Antiepileptika wurden bei epileptiformer Aktivität appliziert, die entweder durch niedrige Konzentrationen von Magnesium im Superfusat, durch 4-Aminopyridin oder durch hochfrequente elektrische Stimulation hervorgerufen worden war. Außerdem wurden die Wirkungen von Glutamatrezeptorantagonisten, GABAA- und GABAB- Rezeptorantagonisten, einem GABA- Uptake-Blocker, einem Neurosteroid und von Taurin auf durch niedrig Magnesium induzierte epilepiforme Aktivität untersucht. Akute Schnitte des temporalen Kortex wurden von 3-19 Tage alten Ratten gewonnen. Feldpotentiale und extrazelluläre Kaliumkonzentrationen wurden im Areal CA3 des Hippokampus und im medialen entorhinalen Kortex registriert. Es wurde die Wirkung von Antiepileptika, einem NKCC1 Blocker und einem Carboanhydrase Blocker auf 4-Aminopyridin evozierte epileptiforme Aktivität untersucht. Die wichtigsten Ergebnisse. Epileptiforme Aktivität in organotypischen Kulturen, die durch niedrig Magnesium oder 4-Aminopyridin ausgelöst worden war, wurde durch Antiepileptika nicht blockiert; eine Ausnahme bildeten toxische Konzentrationen von Phenobarbital (200 µM). Die pathophysiologische Relevanz dieser epileptiformen Aktivität wurde durch die reversible Hemmung durch Glutamat Rezeptorantagonisten, einen GABAA Rezeptorantagonisten, einen GABA-Uptake-Blocker und ein Neurosteroid demonstriert. Im Gegensatz zu durch niedrig Magnesium oder 4-Aminopyridin ausgelöster epileptiformer Aktivität wurde diese Aktivität durch Antiepileptika blockiert, wenn sie durch hochfrequente elektrische Stimulation ausgelöst worden war. In Akutschnitten des temporalen Kortex wurde in der ersten postnatalen Woche unter Antiepileptika und einem Carboanhydrasehemmer Pharmakoresistenz beobachtet, die sich im Verlauf der 2. Woche zurückbildete. Der NKCC1 Blocker unterdrückte epileptiforme Aktivität in der ersten, nicht in der zweiten postnatalen Woche. Schlussfolgerungen. Meine Untersuchungen zeigen, dass organotypische Kulturen des Hippokampus von Ratten in Abhängigkeit von der Art der Provokation epileptiformer Aktivität als in vitro Modell entweder pharmakoresistenter Epilepsie oder pharmakosensitiver Epilepsie eingesetzt werden können. Die Versuche mit akut entnommenem temporalen Kortex demonstrieren, dass epileptiforme Aktivität in dieser Hirnregion in der ersten postnatalen Woche pharmakoresistent ist und dass bei der Ausprägung dieser Pharmakoresistenz der Kotransporter NKCC1 beteiligt ist.