Induktion von Zytokinese und Mitose bei Herzmuskelzellen

Abstract

Adulte Herzmuskelzellen sind Zellen, die ihre endogene Fähigkeit zur Zellteilung postnatal verloren haben. Wichtige Voraussetzung der mitotischen Teilung ist eine vorangegangene DNA-Replikation. Der präreplikative Komplex spielt bei der Initiierung der DNA-Synthese eine entscheidende Rolle. Da DNA- Replikation und hypertrophes Zellwachstum frühe Signalwege auf molekularer Ebene teilen, ist anzunehmen, dass der präreplikative Komplex nicht nur Bestandteil DNA-Replikations-relevanter, sondern auch Hypertrophie- assoziierter Signalwege ist. Die vorliegende Arbeit untersuchte erstmals Faktoren des präreplikativen Komplex bei Herzmuskelzellen. In proliferierenden Zellen sind die Faktoren des pre RC ORC4, MCM2, MCM5, MCM6 und cdc47/MCM7 im Western Blot detektierbar. Auch neonatale Cardiomyozyten weisen diese Faktoren am 5. postnatalen Tag auf. In adulten Kardiomyozyten gelang unter basalen Bedingungen kein Nachweis. Zur Beantwortung der Frage, ob Faktoren des präreplikativen Komplex am postulierten gemeinsamen zellulären Signalweg von DNA-Replikation und Hypertrophie beteiligt sind, wurden adulte Kardiomyozyten mit Wachstumsfaktoren stimuliert. Anschließend wurde ein Ganzzellextrakt der stimulierten Zellen gewonnen. Interessanterweise wiesen die stimulierten, adulten Kardiomyozyten ein differenzielles Proteinexpressionsmuster auf. Im Gegensatz zu unstimulierten, adulten Kardiomyozyten gelang bei den mit Wachstumsfaktoren stimulierten Zellen der Nachweis von MCM5 und MCM6 im Western Blot, MCM2, cdc47/MCM7 und ORC4 konnten hingegen nicht nachgewiesen werden. Terminal differenzierte Kardiomyozyten antworten demnach auf den Wachstumsstimulus Serum mit einer teilweisen Aktivierung des präreplikativen Komplex. Sie verhalten sich zunächst wie proliferierende Zellen auf dem Weg zur S-Phase, ohne jedoch DNA-Synthese oder Zytokinese einzuleiten. Regeneration von postmitotischem Myokard kann durch Rekrutierung und Differenzierung von Vorläuferzellen oder durch Induktion von Zytokinese in morphologisch und funktionell ausdifferenzierten Kardiomyozyten erzielt werden. Im Rahmen der Dissertation wurde die Hypothese untersucht, ob Stimulation isolierter Herzmuskelzellen der Ratte mit exogen zugeführten Zellzyklusfaktoren Mitose und Zytokinese induzieren kann. 5 Tage alte, neonatale Kardiomyozyten und 12 Wochen alte, adulte Kardiomyozyten der Ratte wurden mit E2F2, Zyklin D1 und CDK4 in Gegenwart von 10 % Pferdeserum adenoviral transfiziert. 72 Stunden nach Transfektion erfolgten indirekte immunzytochemische Untersuchungen. Antikörper gegen phosphoryliertes Histon H3 wurden benutzt, um mitotische Kardiomyozyten zu identifizieren. Die zusätzliche Darstellung des Spindelfaserapparats durch Antikörper gegen alpha- Tubulin ermöglichte die Unterscheidung zwischen mitotischen und zytokinetischen Herzmuskelzellen. Nur im Rahmen der Zellteilung kommt es zu einer mechanischen Durchtrennung des Spindelfaserapparats durch den sich einschnürenden kontraktilen Ring und damit zur Entstehung des für die Zytokinese charakteristischen midbody. 9 % der adenoviral mit E2F2, CDK4 oder Zyklin D1 transfizierten, neonatalen Zellen wiesen ein positives PiH3 Signal auf. Zytokinesen konnten in 1.3%der adenoviral transfizierten, neonatalen Kardiomyozyten beobachtet werden. Interessanterweise führte die alleinige adenovirale Transfektion adulter Herzmuskelzellen mit E2F2 nicht zumWiedereintritt in den Zellzyklus. Die Ko-Expression von E2F2 mit Zyklin D1 und CDK4 in adulten Kardiomyozyten resultierte in 3 % Mitose, ohne Nachweis von Zytokinese. Die vorliegende Arbeit beweist, dass terminal differenzierte Herzmuskelzellen zum Wiedereintritt in den Zellzyklus befähigt sind und liefert neue Ansätze für die Entwicklung therapeutischer Strategien zur endogenen Myokardregeneration.

Adult cardiomyocytes have lost their endogenous ability to divide postnatal. Succesful DNA replication is a necessary condition for any mitotic cell division. The pre-replicative complex (pre- RC) plays a substantial role for the initiation of DNA synthesis. There are common early molecular pathways shared by DNA replication and hypertrophic cell growth. Therefore, the pre-RC could be a component involved not only in DNA replication but also in hypertrophic cell growth. The thesis investigated factors of the pre-RC within cardiomyocytes for the very first time. In cultured fibroblasts of the rat pre-RC factors ORC4, MCM2, MCM5, MCM6 and cdc47/MCM7 were detected at protein level. These factors were also detected at five days old neonatal cardiomyocytes. There was no proof of pre-RC factors in adult cardiomyocytes under baseline conditions. Adult cardiomyocytes were stimulated with growth factor serum to initiate hypertrophic cell growth. Subsequently whole cell extract of stimulated adult cardiomyocytes was obtained and analyzed for pre- RC factors. Interestingly, stimulated adult cardiomyocytes revealed a differentiated cluster of protein expression. In contrast to unstimulated adult cardiomyocytes there was western blot detection of MCM5 and MCM6 in serum stimulated adult cardiomyocytes. However, there was no proof of ORC4, MCM2 and cdc47/MCM7 at protein level in serum stimulated adult cardiomyocytes. Terminal differentiated adult cardiomyocytes respond to serum stimulation with partly activation of the pre-RC. Serum stimulated cardiomyocytes react like proliferating cycling cells on their way to S phase but do not induce DNA synthesis and cytokinesis. Regeneration of postmitotic myocardium can be achieved by recruitment and differentiation of stem cells as well as initiation of cytokinesis in adult cardiomyocytes. The thesis gives proof that stimulation of isolated cultured cardiomyocytes of the rat with exogenous added cell cycle factors initiates mitosis and cytokinesis. Therefore five days old neonatal cardiomyocytes and 12 weeks old adult cardiomyocytes were isolated and adenoviral transfected with E2F2, Cyclin D1 and CDK4 in the presence of 10% horse serum. Immunocytochemical analysis was performed 72 hours after adenoviral transfection. Mitotic cardiomyocytes were identified by antibodies against phosphor-histon H3 (PiH3). Additionally immunocytochemical visualisation of the spindle apparatus was achieved through antibodies against alpha tubulin in order to distinguish between mitotic and cytokinetic cardiomyocytes. In contrast to caryogenesis cytokinesis leads to formation of the divison furrow and subsequently to mechanical interruption of spindle fibers. Only the immunocytochemical detection of the midbody structure proofs cytokinesis in multinuclear cardiomyocytes. 9 % of neonatal cardiomyocytes which were adenoviral transfected with E2F2, CDK4 or Cyclin D1 showed immunocytochemical detection of PiH3 and therefore were recognized as mitotic. Cytokinesis was observed in 1.3 % of the adenoviral transfected neonatal cardiomyocytes. Interestingly, single transfection of adult cardiomyocytes with E2F2 resulted not in cell cycle reentry. Mitosis was observed in 3 % in adult cardiomyocytes which were co-transfected with E2F2, CDK4 and Cyclin D1. There was neither immunocytochemical proof of cytokinesis in adenoviral transfected adult cardiomyocytes nor in untransfected adult cardiomyocytes. This thesis delivers strong evidence that terminal differentiated cardiomyoctes are capable of reentry the cell cycle. A better understanding of the cell cycle of cardiomyocytes is preliminary for developing new therapeutic strategies for myocardial regeneration.