Functional and molecular characterization of receptor-activated cation currents in a vascular smooth muscle cell line: A role for TRPC channels.

Abstract

Mammalian homologues of the Drosophila transient receptor potential (TRP) protein, more specifically TRPC1-7, have been proposed to function as receptor-stimulated Ca2+ entry channels. To date, the properties of TRPC1-7 have been extensively studied in heterologous expression studies. By contrast, relatively little information is available on their role in native tissues. Therefore, the major aim of this study was to evaluate the possible role of TRPC1-7 in vasoconstrictor-induced Ca2+ entry in rat A7r5 aortic smooth muscle cells.

In A7r5 cells, [Arg8]-vasopressin (AVP) induced an increase in the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) consisting of Ca2+ release and Ca2+ influx. Whole-cell voltage-clamp recordings revealed the activation of a nonselective cation current with a doubly-rectifying I-V relation strikingly similar to those described for some heterologously-expressed TRPC isoforms. The current was inhibited by lanthanum (La3+) and gadolinium (Gd3+). External Ca2+ exerted complex effects, involving both facilitatory and inhibitory mechanisms. Direct activation of G proteins by infusion of aluminium fluoride activated a cation current with properties identical to those of the AVP-induced current. Furthermore, activation of the PLCg -coupled platelet-derived growth factor receptor also stimulated the current. However, current activation was neither dependent on store depletion nor on increased [Ca2+]i. Since currents identical to those evoked by AVP were activated by application of 1-oleoyl-2 -acetyl-sn-glycerol (OAG) in a protein kinase C-independent way, the TRPC3/6/7 subgroup is suggested to be involved in mediating these currents. Like TRPC6-mediated currents, cation currents in A7r5 cells were increased by flufenamate. Northern hybridization revealed mRNA coding for TRPC1 and TRPC6. Hence, TRPC6 is suggested to be a determining molecular component of receptor- stimulated Ca2+-permeable cation channels in A7r5 cells.

To investigate whether TRPC6 plays a more general role in vascular smooth muscle, two other smooth muscle cell preparations were examined. In smooth muscle cells derived from the rat vena cava, AVP stimulated Ca2+ influx. However, activation of a corresponding cation current could not be detected, and no mRNA for TRPC2-6 was found in this cell line. Preliminary studies on primary cultures of smooth muscle cells derived from neonatal and adult rat aorta revealed the activation of a cation current similar to the current observed in A7r5 cells.

To compare the properties of the native currents in A7r5 cells with those mediated by heterologously-expressed TRPC6, rat TRPC6 was cloned and electrophysiologically characterized in recombinant expression studies. Furthermore, the properties of recombinant TRPC6 were compared to those of mouse TRPC5, which belongs to the structurally and functionally distinct TRPC4/5 subgroup of TRPC channels. External Ca2+ was found to have an inhibitory effect on currents mediated by rat TRPC6, whereas currents through recombinant mouse TRPC5 were potentiated by increased extracellular Ca2+. Moreover, rat TRPC6 was blocked by external La3+ or Gd3+, while whole-cell currents through mouse TRPC5 were reversibly stimulated by micromolar and inhibited by millimolar concentrations of both ions. The dual effects of La3+ on mTRPC5 were also reflected on the single-channel level, with increasing La3+ concentrations reducing the single-channel conductance, but increasing the open probability. Hence, external Ca2+ and micromolar concentrations of La3+ and Gd3+ have opposite effects on whole-cell currents through recombinant TRPC5 and TRPC6 channels and may be a tool to identify and discriminate the involvement of the TRPC3/6/7 and the TRPC4/5 subgroup in receptor-operated cation conductances of native cells.

The major finding of the present study is that TRPC6 is a molecular component of vasoconstrictor-activated cation channels in A7r5 smooth muscle cells. Importantly, the present study demonstrates that an endogenous receptor- stimulated cation current shows properties identical to those described for TRPC isoforms in heterologous overexpression studies.

Die Applikation von [Arg8]-Vasopressin (AVP) löste in A7r5-Zellen einen Anstieg der cytosolischen Ca2+-Konzentration aus, der aus einer Ca2+-Freisetzungs- und einer Ca2+-Einstromkomponente bestand. In Patch-Clamp- Experimenten führte die Applikation von AVP in A7r5-Zellen zur Aktivierung eines nichtselektiven Kationenstroms. Dieser Kationenstrom zeigte eine charakteristische, doppelt rektifizierende Strom-Spannungs-Beziehung, die den für einige rekombinant-exprimierte TRPC-Kanäle beschriebenen Kennlinien auffallend ähnelte. Der AVP-induzierte Kationenstrom wurde durch Lanthan (La3+) und Gadolinium (Gd3+) blockiert. Die Effekte von extrazellulärem Ca2+ auf den Kationenstrom waren komplex und umfassten sowohl stimulierende als auch inhibierende Anteile. Die direkte Aktivierung von G-Proteinen durch Infusion von Aluminiumfluorid aktivierte einen Kationenstrom, der die gleichen Eigenschaften besaß wie der AVP-induzierte Strom. Desweiteren führte auch die Stimulation von Rezeptoren (z.B. durch PDGF = platelet-derived growth factor), die an an PLCg koppeln, zur Aktivierung des beschriebenen Kationenstroms. Sowohl die Entleerung intrazellulärer Speicher als auch die Erhöhung der cytosolischen Ca2+-Konzentration konnten als Aktivierungsmechanismus ausgeschlossen werden. Dagegen aktivierte 1-Oleoyl-2-acetyl-sn-Glycerol (OAG), ein membranpermeables DAG-Analog, den Kationenstrom. Diese Aktivierung war unabhängig von Proteinkinasen C (PKC). Die PKC-unabhängige Aktivierung durch DAG-Analoga ist eine charakteristische Eigenschaft der Kanäle der TRPC3/6/7-Gruppe. Ebenso wie die Ströme durch den heterolog exprimierten TRPC6-Kanal wurde der endogene Kationenstrom in A7r5-Zellen durch Applikation von Flufenamat vergrößert. Northern-Blot-Hybridisierungs-analysen zeigten, dass A7r5-Zellen lediglich mRNA für TRPC1 und TRPC6 exprimieren. Die Übereinstimmung von elektrophysiologischen und molekular-biologischen Befunden legt nahe, dass TRPC6 eine wichtige Komponente des AVP-aktivierten Kationenkanals in A7r5-Zellen ist.

Um zu untersuchen, ob TRPC6 generell in der glatten Gefäßmuskulatur von Bedeutung ist, wurden zwei weitere Präparationen von glatten Gefäßmuskel- zellen betrachtet. In glatten Muskelzellen der Vena cava der Ratte, löste AVP ebenfalls einen Ca2+-Einstrom aus. Allerdings konnte in diesen Zellen weder ein agonistinduzierter Kationenstrom noch mRNA für TRPC2 - 6 nachgewiesen werden. Vorläufige Untersuchungen an primärkultivierten glatten Muskelzellen der Aorta neonataler und adulter Ratten zeigten dagegen die Aktivierung eines Kationenstroms, der dem in A7r5-Zellen beobachteten Strom sehr ähnlich war.

Um die Eigenschaften der nativen Ströme in A7r5-Zellen mit denen von heterolog exprimiertem TRPC6 zu vergleichen, wurde das Rattenortholog von TRPC6 (rTRPC6) kloniert und nach rekombinanter Expression elektrophysiologisch charakterisiert. Außerdem wurde das Verhalten von rTRPC6 mit dem von mTRPC5 (aus Maus) verglichen. TRPC5 gehört zu der TRPC4/5-Untergruppe, die sich strukturell und funktionell von der TRPC3/6/7-Untergruppe unterscheidet. Extrazelluläres Ca2+ hatte eine hemmende Wirkung auf rTRPC6, während die Stromamplitude im Falle von mTRPC5 durch Erhöhung der extrazellulären Ca2+-Konzentration vergrößert wurde. Für rTRPC6 konnte eine Hemmung durch La3+ und Gd3+ gezeigt werden. mTRPC5-Kanäle wurden durch millimolare Konzentrationen von La3+ und Gd3+ ebenfalls blockiert, mikromolare Konzentrationen wirkten dagegen potenzierend. Der duale Effekt von La3+ auf mTRPC5 war auch auf der Einzelkanalebene zu beobachten. Die Einzelkanalleitfähigkeit nahm mit ansteigender La3+-Konzentration ab, die Öffnungswahrscheinlichkeit hingegen nahm zu. TRPC5- und TRPC6-Kanäle werden also durch extrazelluläres Ca2+ sowie durch La3+ und Gd3+ unterschiedlich reguliert. Diese Eigenschaften sind deshalb ein wichtiges Hilfsmittel, um die Beteiligung von Kanälen der TRPC3/6/7- bzw. der TRPC4/5-Gruppe an Rezeptor- vermittelten Kationenleitfähigkeiten in nativen Zellen nachzuweisen und zwischen beiden Kanalgruppen zu unterscheiden.

Der wichtigste Befund der vorliegenden Arbeit ist, dass TRPC6 eine molekulare Komponente des Rezeptor-stimulierten Kationenkanals in A7r5-Zellen darstellt. Insbesondere zeigt die vorliegende Studie eine klare Übereinstimmung zwischen endogenen Rezeptor-stimulierten Kationenströmen und solchen, die nach rekombinanter Überexpression einzelner TRPC-Isoformen beobachtet werden.