Molekularzytogenetische Untersuchungen von Vorstufen des Mammakarzinoms

Abstract

Durch ein verstärktes Mammographie-Screening in den letzten Jahren werden neben den bereits gut untersuchten invasiven Karzinomen vermehrt in situ Karzinome nachgewiesen, deren Inzidenz bezogen auf alle im Rahmen dieser Vorsorge-untersuchungen erfassten Läsionen auf etwa 20 % geschätzt wird. Es handelt es sich hierbei meist schon um entartete Zellen, die als Krebsvorstufen gelten und aus denen sich bei Nichtbehandlung ein invasives Karzinom entwickeln kann. Daher ist die Aufdeckung genetischer Veränderungen in frühen Vorläuferstadien wichtig und könnte zu einem besseren Verständnis der Tumorentwicklung und einer verbesserten Diagnostik beitragen, um eine auf die Patientin optimal abgestimmte Therapie zu ermöglichen. Ausgehend von formalinfixiertem und in Paraffin eingebetteten Geweben, das z. T. mehrere Jahre alt ist, konnten mit Hilfe der Laser-Mikrodissektion wenige Millimeter große, histologisch definierte Zellareale exakt separiert und diese mittels CGH-Techniken auf ihre genetischen Veränderungen analysiert werden. Zur Vervielfältigung der isolierten genomischen DNA vor der CGH-Analyse war die Ligations-PCR nach Klein et al. (1999) am besten geeignet. Bei zehn untersuchten Patientinnen mit einer ADH wurden nur sehr vereinzelt Aberrationen aufgefunden (z. B. 16q und +20q). 15 Patientinnen mit einem LCIS zeigten Zugewinne auf den Chromosomenarmen 1q (87 %), 6p (40 %), 17q (40 %) und 20q (33 %) sowie Verluste auf 16q (73 %) als charakteristische Veränderungen. Die Analyse von 23 Patientinnen mit einem DCIS ergab sehr komplexe Aberrationen, die denen der IDC ähnelten, wie häufige Zugewinne auf den Chromosomenabschnitten 1q (61 %), 6p (35 %), 8q (43 %), 17q (65 %), 20q (39 %) und Verluste auf 8p (52 %), 10q (30 %), 16q (39 %), 17p (43 %) und 18p (30 %). Amplifikationen traten vermehrt auf den Chromosomenarmen 1q (17 %), 14q (13 %), 17q (43 %) und 20q (26 %) auf. Die Region 17q21, in die das Onkogen Her 2/neu kartiert, welches ein hohes Malignitätspotential besitzen kann, war bereits bei den in situ Karzinomen (Frequenz DCIS zirka 60 %; Frequenz LCIS zirka 40 %) häufig durch Amplifikationen aufgefallen. Bei sieben Patientinnen mit einem IDC wurden Amplifikationen in der Region 1q32 entdeckt und für sechs Patientinnen mit einem ILC waren Zugewinne auf den Chromosomenarmen 1q und 16p charakteristisch. Die Detektion genetischer Veränderungen in als morphologisch „normal“ eingestuften Epithelzellen bei 2 von 13 laser-mikrodissezierten Gewebeproben in näherer Umgebung vom Tumor war überraschend und könnte für die Patientin schwerwiegende Folgen haben. Würden nach der Entfernung eines Tumors wenige genetisch veränderte Zellen, die aber morphologisch als solche nicht erkennbar sind in der Brust verbleiben, könnten diese zur Bildung eines Rezidivs, das auch invasiv sein kann, beitragen. Um das zu verhindern, ist ein ausreichend großer, von Tumorzellen freier Resektionsrand notwendig. Eine Kombination aus histopathologischer und genetischer Analyse wäre daher sinnvoll. Durch hierarchische Clusteranalyse wurden alle durch CGH analysierten Proben anhand ähnlicher Aberrationsmuster unabhängig vom Tumortyp in fünf Hauptgruppen zusammengefasst. So wurden z. B. hoch aberrante Tumore, meist DCIS Grad 2 und Grad 3 dem Cluster 3 zugeteilt und DCIS Grad 1 und LCIS mit Zugewinnen chromosomalen Materials auf 1q und gleichzeitigem Verlust auf 16q dem Cluster 4. Es wurde an ausgewählten DCIS gezeigt, dass die Ergebnisse der konventionellen CGH mit der Array-CGH-Technik mittels eines zirka 6.000 BACs umfassenden DNA-Chips (Auflösung etwa 0,6 Mb) reproduziert und zusätzliche Veränderungen detektiert werden können. Die Amplifikation der Bande 14q12 bei Tumorprobe 86 wurde bestätigt und auf eine Größe von 3,2 - 5,6 Mb eingegrenzt. In diese Region kartieren 24 Gene, deren potentielle Bedeutung zur Entstehung von Brustkrebs bisher unbekannt ist. Daher wären weiterführende Analysen z. B. zur Genexpression notwendig, um herauszufinden, welche dieser Gene als Onkogen-Kandidaten für die Tumorgenese verantwortlich sein können. Prinzipiell muss bei der Array-CGH-Analyse von Tumor-DNA aus Paraffinmaterial berücksichtigt werden, dass die Qualität der Ausgangs-DNA gegenüber unfixierter DNA, z. B. aus frischem OP-Material oder kryokonserviertem Gewebe, vermindert ist. Weiterhin werden durch die genomische Amplifikation der fixierten DNA zusätzliche Streuungen der Einzelwerte verursacht, so dass nicht jede Probe uneingeschränkt ausgewertet werden kann. Für einen routinemäßigen Einsatz der Array-CGH-Methode mit fixierter DNA in der Klinik ist es derzeit wegen einer unzureichenden Standardisierung noch zu früh. Um frühe Brustkrebsstadien zu diagnostizieren, könnten neben bekannten Prognosemarkern wie z. B. ER, PgR, HER-2/neu, Ki-67 und Ploidiestatus spezielle FISH-Sonden als Ergänzung zur histopathologischen Diagnostik eingesetzt werden. Dabei muss im Vergleich zur CGH-Technik berücksichtigt werden, dass häufige rekurrente Aberrationen mit einzelnen Sonden zwar mit einer höheren Empfindlichkeit erfasst, aber nicht das gesamte Genom analysiert werden kann. Mit Hilfe selbst hergestellter, lokusspezifischer FISH-Sonden für die Regionen 1q32, 16q22, 17q21 und 20q13 würden bezogen auf die eigenen CGH-Daten 90 % aller Brusttumore, einschließlich der in situ und invasiven Karzinome identifiziert werden. Auch in Zukunft werden die Einteilung von Tumorläsionen in klinisch relevante Subgruppen anhand pathologischer und molekularer Marker und die Identifizierung von Prognosefaktoren von Bedeutung sein, damit eine effiziente individuelle Therapie möglich sein wird.

The intensive mammographic screening program in the last years has lead to the detection of well investigated invasive carcinomas and also to the finding of an increased number of in situ carcinomas, whose incidence is estimated at 20 %. These lesions consist usually of abnormal cells and may lead to the development of invasive carcinoma if left untreated. The detection of genetic alterations in early lesions is, therefore, important and could contribute to a better understanding of tumor progression for improved diagnostics and for individualized therapeutic strategies. Using laser microdissection of formalin-fixed and paraffin-embedded tissue, small histologically defined cell areas, just millimeters in size, could be investigated with CGH techniques for detection of copy number changes. Ligation mediated PCR according to Klein et al. (1999) was optimally adapted for amplification of isolated genomic DNA before CGH analysis. Ten patients with ADH showed only sporadic chromosomal aberrations ( 16q and +20q). 15 cases with LCIS had gains including chromosomes 1q (87 %), 6p (40 %), 17q (40 %) and 20q (33 %) and also losses of 16q (73 %) as typical genetic changes. The analysis of 23 patients with DCIS resulted in highly complex aberrations, which are comparable with those of invasive carcinomas, involving recurrent aberrations such as gains of chromosome arms 1q (61 %), 6p (35 %), 8q (43 %), 17q (65 %), 20q (39 %) and losses of 8p (52 %), 10q (30 %), 16q (39 %), 17p (43 %) and 18p (30 %). Amplifications were frequently seen on chromosomal arms 1q (17 %), 14q (13 %), 17q (43 %) and 20q (26 %). The region 17q21, known to contain the oncogene Her 2/neu, which is characterized as having a high malignancy potential, was often amplified in in situ carcinomas (frequency DCIS ~60 %, LCIS ~40 %). In seven patients with IDC, amplifications were detected in the region of 1q32 and also six ILC patients showed typical gains on chromosomal arms 1q and 16p. Genetic changes were surprisingly found in 2 of 13 laser-microdissected tissue samples from epithelial cells classified as “normal”, found near the tumor cells, which could lead to a more severe outcome among patients. In these cases, a few abnormal cells are overlooked due to their normal morphological appearance and remain in the breast after excision of the tumor. This may lead to the occurrence of relapse and invasive cancer. To avoid this, a sufficient resection margin, free of tumor cells, is required. A histopathological diagnosis as well as a genetic analysis would therefore be advisable. Applying hierarchical cluster analysis, all CGH analyzed samples were clustered according to similar patterns of alterations independent of tumor type and summarized into five main groups. Thus, highly aberrant tumors, most of them intermediate- and high-grade DCIS, were grouped into cluster 3 and low-grade DCIS and LCIS with gains of chromosomal material of 1q and corresponding loss of 16q into cluster 4. As shown from selected DCIS samples, conventional CGH results could be reproduced applying a 6,000-BAC array (resolution ~0.6 Mb). Additional alterations were also detected. The amplified region on band 14q12 in tumor sample 86 was confirmed and narrowed down to a size of 3.2 - 5.6 Mb. Twenty four genes are located in the region and their relevance for breast cancer progression has not yet been investigated. Gene expression studies are necessary to determine, which of these genes are putative oncogene and could be responsible for tumor progression. Consideration should be taken using this approach as the quality of tumor DNA extracted from paraffin-embedded tissue is reduced compared to that of DNA from fresh or frozen tissue samples. Furthermore, amplification of fixed genomic DNA can lead to an increased standard deviation of data, and not all samples should be included in the evaluation. Due to this insufficient validation of data it is still too early for the routine use of array CGH to analyze paraffin-embedded tissue. To diagnose early breast cancer lesions, in addition to using well-established prognostic markers such as ER, PgR, HER 2/neu, Ki-67 and DNA ploidy status, specific FISH probes could be applied for histopathological diagnostics. It should be considered that common recurrent aberrations can be detected with higher sensitivity with specific FISH probes. However, this technology does not allow for a genome-wide analysis. Using custom-generated FISH probes from different chromosomal loci such as 1q32, 16q22, 17q21 and 20q13, 90 % of the breast cancer cases in our study including in situ and invasive cancer could be identified. In the future, the classification of tumor lesions into clinically relevant subgroups using pathological and molecular markers and the identification of prognostic factors will be important to enable an efficient personalized therapy.