Wirkung von Chitosan auf die parazelluläre und transzelluläre Barrierefunktion von HT-29/B6-Kolonepithelzellen

Abstract

Einleitung: Die häufigste Art Medikamente zu verabreichen ist die orale Einnahme. Die heutige Entwicklung von großmolekularen Medikamenten auf Protein- oder Peptidbasis birgt jedoch das Problem einer eingeschränkten intestinalen Bioverfügbarkeit. Aufgrund ihrer hydrophilen Eigenschaften und des hohen Molekulargewichts können diese Substanzen nicht transzellulär über die Lipidphase oder Transportproteine transportiert werden. Die Alternative, die parazelluläre Resorption, wird durch den interzellulären Multiprotein- komplex der Tight Junction limitiert. Diese dichten den interzellulären Spalt zwischen zwei Epithelzellen ab, nur einige Tight Junction-Proteine bilden selektive parazelluläre Kanäle für Elektrolyte und Wasser. Die Entwicklung von reversibel wirksamen Absorptionsbeschleunigern, welche die Passage großmolekularer Stoffe durch die Tight Junction ermöglichen, ist daher von hohem Interesse. Chitosan und seine Derivate induzieren an verschiedenen Epithelien einen absorptionsbeschleunigenden Effekt, basierend vermutlich auf einer Öffnung der Tight Junction. Die molekulare Wirkungs- weise ist jedoch bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit wurde die Wirkung von Chitosan auf die Barrierefunktion von HT-29/B6- Zellen, einem etablierten intestinalen Epithelzellmodell untersucht. Methodik: Für sämtliche Versuche wurde niedrig- molekulares Chitosan mit einem Molekular- gewicht von 50-190 kDa sowie einem Deacetylierungsgrad von 75-85 % verwendet. Es wurden Chitosan-Konzentration zwischen 0.1-0.002 % getestet, die Zugabe erfolgte stets auf apikaler Zellseite. Messungen der Zytotoxizität erfolgten über die Laktatdehydrogenase- Bestimmung. Der Chitosan-Effekt auf die Barriereeigen-schaften des Epithels wurde mittels Messungen des transepithelialen elektrischen Widerstands und des transpeithelialen Stromflusses sowie der parazellulären Mannitol- und FITC- Dextran-Fluxe überprüft. Mit Hilfe der Zwei-Wege-Impedanzspektroskopie erfolgte die quantitative Differenzierung des epithelialen Widerstands in parazellulären und transzellulären Widerstand. Untersuchungen zur Tight Junction-Integrität umfassten Western-Blot-Analysen und Immunfluoreszenz- Färbungen von Tight Junction-Proteinen und des Zytoskeletts mit anschließender konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie. Ergebnisse: Es konnte gezeigt werden, dass Chitosan 1) an HT-29/B6-Zellen in Konzentrationen bis zu 0.005% keine toxischen Eigenschaften besitzt. 2) in einer Konzentration von 0.005 % zu einer schnellen konzentrationsabhängigen und nach Entfernen des Polymers vollständig reversiblen Abnahme des transepithelialen elektrischen Widerstands führt. 3) zu einer Zunahme der parazellulären Permeabilität für Mannitol- und FITC-Dextran bis zu einer Molekülgröße von 10 kDa führt. 4) seine Wirkung weder durch eine Umverteilung oder veränderte Expression von Tight Junction- oder Tight Junction-assoziierten Proteinen, noch durch einen Einfluss auf das Aktinskelett entfaltet. 5) einen Einfluss sowohl auf den parazellulären, als auch den transzellulären Widerstand hat. Am transzellulären Effekt scheint die Aktivierung eines Anionenstroms beteiligt zu sein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Chitosan in nicht-toxischen Konzentrationen einen schnellen, reversiblen und größenselektiven Anstieg der parazellulären Permeabilität induziert und damit die notwendigen Anforderungen an einen Absorptionsenhancer erfüllt.

Introduction: Oral administration is the easiest way to apply pharmaceuticals. However, today's drugs often have a limited oral bioavailability because of their high molecular weight, their hydrophilic nature or their protein basis, which inhibits the transcellular transport through the lipophilic cell membrane or via transport proteins. Another possibility is the paracellular resorption, which is limited due to tight junctions, which are intercellular multiprotein-complexes sealing the intercellular space. Consequently, the development of absorption enhancers which act in a reversible manner and allow the paracellular transport of high molecular molecules throughout the tight junction is of high interest. Chitosan, a derivative of chitin of crustacean cells, has an absorption enhancing effect on different epithelia, presumably based on an opening of tight junctions. However, it's detailed molecular mode of action is widely unknown. In this thesis, the effect of chitosan on barrrier properties was investigated on HT-29/B6- cells, an established epithelial cell model. Methods: Low-molecular-Chitosan (50-190 kDa) with a grade of deacetylation of 75-85 % was used for all experiments. It was applied on the apical side of the cells at concentrations from 0.1-0.002%. Cytotoxicity-measurements were performed via lactate- dehydrogenase- determination. The effects of chitosan on barrier properties were examined by measurements of the transepithelial electrical resistance and by detection of transepithelial currents as well as by paracellular mannitol- and FITC- dextrane fluxes. The quantitative differentiation of the epithelial resistance into paracellular and transcellular resistance was investigated by two-path- impedance-spectroscopy. In order to determine the integrity of tight junctions, Western-blot-analyses and immunofluorescence staining of tight junction-proteins and the cytoskeleton with subsequent confocal laser scanning microscopy were performed Results: It was shown that chitosan 1) is not toxic at HT-29/B6-cells within concentrations up to 0.005 %. 2) induces a fast and fully reversible decrease in transepithelial electrical resistance at concentrations of 0.005 %. 3) leads to an increase of paracellular permeabilty for mannitol and FITC dextrane up to 10 kDa. 4) is not associated with redistribution or changed expression of tight junction proteins, nor with effecting the actin cytoskeleton. 5) influences both the paracellular and transcellular resistance, whereupon the activation of an anionic current seems to be involved in the transcellular effect. In conclusion, chitosan induces, if used in non toxic concentrations, a fast, reversible and selective increase in paracellular permeability and fulfils the requirements of an absorption enhancer.