dc.contributor.author
Kirstein, Janine
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:08:34Z
dc.date.available
2007-09-27T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5792
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9991
dc.description
0\. Title, Content, Summary
1\. Summary 6
2\. Introduction 10
3\. Results and Discussion 30
3.1. A tyrosine kinase and its activator control the activity of the CtsR
heat shock repressor in B. subtilis 30
3.2. Adaptor protein controlled oligomerization activates the AAA+ protein
ClpC 36
3.3. Cyanobacterial ClpC/HSP100 protein displays intrinsic chaperone activity
42
3.4. The tyrosine kinase McsB is a regulated adaptor protein for ClpCP 44
4\. Outlook and Discussion 53
5\. Literature 61
7\. Abbreviations 71
8\. Acknowledgements 72
Publications
dc.description.abstract
The main objective of my PhD thesis was the analysis of the functional
relationship of the HSP100/Clp protein ClpC with its adaptor proteins. ClpC is
not only involved in the removal of misfolded and aggregated proteins, but
also controls, through regulated proteolysis, key steps of several
developmental processes in the Gram-positive bacterium Bacillus subtilis. ClpC
differs from other members of the HSP100 family in that it requires an adaptor
protein for virtually all its activities. A variety of molecular biological,
biochemical and biophysical methods were employed to address the mechanistic
and functional interplay of ClpC and its adaptor protein network. (1) It could
be demonstrated that the activation of ClpC is based on the adaptor mediated
assembly of the ClpC hexamer and that the oligomerized complex constitutes the
functional and substrate binding species of this chaperone complex. (2) It
could be shown that the formation of the whole proteolytic complex, ClpCP,
depends on the preceding adaptor mediated assembly of the ClpC oligomer. Once
assembled, hexameric ClpC facilitates the oligomerization and thereby
activation of the otherwise monomeric proteolytic component, ClpP. Thus, ClpCP
mediated proteolysis appears to be regulated in a hierarchic mode governed by
an adaptor protein. (3) A functional characterization of a ClpC homolog from a
photobiontic organism revealed that the adaptor dependent activation is not a
common feature among the ClpC homologs. Thus, ClpC of B. subtilis exhibits a
unique characteristic even within the ClpC family. Besides the activation of
ClpC, adaptor proteins fulfill also a substrate recognition role enabling the
specific degradation of a huge variety of substrate proteins by ClpCP. The
substrate spectrum of ClpCP includes key regulators such as ComK, ComS,
SpoIIAB, CtsR and MurAA. The wide range of ClpC substrates argues for a
substantial number of ClpC adaptors to allow a specifically controlled
degradation. The cognate adaptor protein for one of these regulatory proteins,
CtsR, could be identified and thus (4), adding McsB to the adaptor protein
network of ClpC. McsB could be characterized as tyrosine kinase, exhibiting
adaptor properties only in its kinase-on state. The kinase activity is crucial
for the regulation of the class III heat shock genes in B. subtilis. (i) McsB
phosphorylates CtsR, which diminishes the DNA-binding ability of CtsR and
marks it for degradation and (ii) only phosphorylated McsB is enabled to
subsequently target CtsR for proteolysis by ClpCP. The kinase activity of McsB
is tightly controlled, as it is induced by its activator McsA and inhibited by
the partner ATPase ClpC and the cognate phosphatase YwlE. Thus, McsB can be
considered as a regulated adaptor protein. (5) Although McsB exhibits no
similarity to the two established ClpC adaptor proteins, MecA and YpbH, all
three use the same binding sites on ClpC. The interaction of adaptor proteins
with ClpC might therefore not occur simultaneously. This assumption was hold
up by the finding that McsB-P could successfully compete with MecA. Finally, a
model of the class III heat shock regulation is proposed, integrating the
novel aspects of the specific adaptor protein for CtsR, McsB, the phospho-
relay between McsB, CtsR and YwlE and the interplay of ClpC with additional
adaptor proteins. The competition of the different adaptor proteins for ClpC
binding might probably constitute a central part of the control of regulated
proteolysis in general.
de
dc.description.abstract
Das Ziel meiner Dissertation war die Aufklärung des funktionellen
Zusammenhangs zwischen dem HSP100/Clp Protein ClpC und seiner Adaptorproteine.
ClpC nimmt eine duale Funktion wahr. Zum einen ist ClpC durch die
unspezifische Proteolyse missgefalteter und aggregierter Proteine ein
Bestandteil der Proteinqualitätskontrolle, darüber hinaus, ist ClpC aber auch
in den gezielten Abbau spezifischer Regulatorproteine involviert. Da diese
Regulatorproteine Schlüsselpositionen in Signaltransduktionswegen einnehmen,
ist ClpC in eine Vielzahl von Entwicklungs-, Differenzierungs- und
Adaptionsprozessen involviert. ClpC bedarf bereits für basale Funktionen einem
Adaptorprotein und in dieser Abhängigkeit unterscheidet sich ClpC von von
homologen Clp ATPasen. In dieser Arbeit wurde eine Vielzahl von
molekularbiologischen, biochemischen und biophysikalischen Methoden genutzt,
um den funktionellen Mechanismus zwischen ClpC und seiner Adaptorproteine
aufzuklären. (1) Es konnte gezeigt werden, dass der zu Grunde liegende
Mechanismus der ClpC Aktivierung in der Adaptor vermittelten ClpC
Oligomerisierung liegt. Der assemblierte Komplex ist zur Substratinteraktion
befähigt und stellt somit den aktiven ATPase-Adaptor-Komplex dar. (2) Dieser
vermittelt darüber hinaus aber auch die weitere Assemblierung zum funktionalen
proteolytischen ClpCP Komplex. Die proteolytische Untereinheit, ClpP, liegt in
B. subtilis als Monomer vor und bedarf für seine Assemblierung in ein aktives
Tetradekamer einem oligomerisiertem ATPase-Hexamer. ClpCP-abhängige Proteolyse
ist daher einer hierarchischen Kontrolle unterlegen: zunächst wird durch ein
Adaptorprotein ClpC in ein aktives Hexamer überführt, welches sodann ClpP
rekrutieren und assemblieren kann. (3) Die Charakterisierung eines
cyanobakteriellen ClpC-Homologs ergab, das dieses für seine Basisaktivität
keinen Adaptor benötigt. Die Abhängigkeit zwischen ClpC und Adaptor ist daher
nicht innerhalb der ClpC-Familie konserviert und scheint somit ein
spezifisches Merkmal des B. subtilis ClpC zu sein. (4) Neben ihrer
Aktivierungsfunktion, vermitteln Adaptorproteine auch die Substraterkennung
für ClpC. Das bisherige ClpC Substraspektrum umfasst die regulatorischen
Proteine ComK, ComS, SpoIIAB, CtsR und MurAA. Die Vielzahl der Substrate lässt
eine entsprechend große Anzahl an Adaptoren vermuten. Der spezifische Adaptor
für CtsR, dem Regulator der Klasse III Hitzeschockgene war bisher unbekannt
und konnte in dieser Arbeit in McsB identifiziert werden. McsB ist damit neben
MecA and seinem Paralog, YpbH, das dritte Adaptorprotein für ClpC. Die
Besonderheit von McsB liegt in seiner zusätzlichen Aktivität als Tyrosinkinase
und dass diese direkt mit der Adaptorfunktion gekopelt ist. Der Kinase kommt
eine zweifache Bedeutung zu (i) McsB phosphoryliert CtsR, welches die CtsR-
DNA-Interaktion aufhebt und (ii) nur im phosphorylierten Zustand ist McsB
befähigt, CtsR an ClpCP zur anschließenden Proteolyse zu zuführen. Die
Kinaseaktivität unterliegt einer strengen Kontrolle. Die Kinaseaktivität von
McsB wird durch sein Aktivatorprotein McsA induziert, durch ClpC inhibiert und
McsB durch seine spezifische Phosphatase YwlE dephosphoryliert. Aufgrund der
Kopplung zwischen Kinase- und Adaptoraktivität kann McsB als regulierter
Adaptor angesehen werden. (5) Obwohl McsB keinerlei Ähnlichkeit zu MecA und
YpbH aufweist, interagiert es mit den gleichen ClpC-Domänen. Dies wiederum
legt die Vermutung nahe, dass sich die simultane Interaktion zweier
verschiedener Adaptorproteine mit ClpC ausschließt. Die Annahme einer
potentiellen Kompetition konnte experimentell erhärtet werden. In seiner
phosphorlyierten Form konnte McsB die Adaptorfunktion von MecA unterdrücken.
Abschließend konnte ein Modell zur Regulation der CtsR Aktivität aufgestellt
werden, das die neuen Erkenntnisse z.B. die Identifizierung des spezifischen
Adaptors für CtsR, McsB, den Phosphattransfer zwischen McsB, CtsR und YwlE und
der Interaktion von ClpC mit seinen weiteren Adaptorproteinen, berücksichtigt.
Die Konkurrenz verschiedener Adaptorproteine könnte generell ein wesentlicher
Bestandteil der Kontrolle der regulierten Proteolyse sein.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
regulated proteolysis
dc.subject
adaptor proteins
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Regulation of the AAA+ protein ClpC by adaptor proteins
dc.contributor.firstReferee
Prof. Kürsad Turgay
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Regine Hengge
dc.date.accepted
2007-09-21
dc.date.embargoEnd
2007-11-01
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000002620-6
dc.title.translated
Regulation des AAA+ Proteins ClpC durch Adaptorproteine
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000002620
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2007/653/
refubium.note.author
Chapter 6. Publications wird hier nicht elektronisch veröffentlicht, da es
Original-Zeitschriftenartikel enthält (siehe Titeldatei)
refubium.mycore.derivateId
FUDISS_derivate_000000002620
dcterms.accessRights.dnb
free
dcterms.accessRights.openaire
open access