Role of estrogen receptor alpha in post-ischemic cardiac protection mediated via bone marrow c-kit+ cells

Abstract

Despite the advances in diagnosis and treatment, myocardial infarction remains a major concern for the health system worldwide. Cell therapy emerged as a novel and promising treatment option aimed to improve cardiac function after ischemia. Whereas no consensus has been reached on potential of bone marrow cells to directly regenerate cardiomyocytes, paracrine secretion seems to represent an important mechanism by which progenitor cells mediate cardioprotection. Cardioprotective actions of estrogen have been well recognized for many years. Recent studies indicate a novel role of estrogen receptors (ER) in stem/precursor cell-involved cardiac repair. C-kit is a transmembrane tyrosine kinase receptor expressed by undifferentiated progenitor cells. Taking into account that cardiac, c-kit-expressing (c-kit+) precursor cells are mainly recruited from bone marrow (BM) c-kit+ cell population, we aimed here to elucidate the functional importance of ERα in BM c-kit+ precursor cells after ischemic heart injury. The c-kit+ cells were isolated from femurs and tibias of male wistar rats 7 days after myocardial infarction (MI) by magnetic activated cell sorting (MACS) in combination with fluorescent activated cell sorting (FACS). After MI, the percentage of c-kit+ cells in BM increased by 2.11 fold. BM c-kit+ cells, which expressed both intracellular and membrane ERα, were shown to inhibit apoptosis of co-cultured cardiomyocytes in a paracrine manner. According to the expression of membrane ERα, BM c-kit+ cells were further sorted using FACS into c-kit+ERα+ and c-kit+ERα- cell populations. BM c-kit+ERα+ cells were more potent in reducing apoptosis of co-cultured cardiomyocytes than BM c-kit+ERα- cells. In addition, the post-ischemic intra-myocardial injection of conditioned medium from c-kit+ERα+ improved systolic and diastolic left ventricular function compared to medium collected from c-kit+ERα- cells. c-kit+ERα+ cells were characterized by increased production of cytokines IL-6 and IL-10, and lower production of IL-11. MI impaired paracrine function of BM c-kit+ cells and stimulation with 17β-estradiol could enhance cytokine production and the BM c-kit+ cell- mediated cardioprotective effect. Importantly, blocking IL-6 by neutralizing antibody abolished the effect of BM c-kit+ERα+ cell in supporting co-cultured cardiomyocytes. Finally, ERα-mediated IL-6 production and reduced percentage of c-kit+ERα+ cells were also observed in blood c-kit+ cells of patients with heart failure. Thus, this work puts forward a novel cardioprotective mechanism mediated by BM c-kit+ERα+ cells via paracrine IL-6.

Trotz des Fortschritts in der Diagnose und Therapie erregt Herzinfarkt noch großes Besorgnis für das Gesundheitssystem in der ganzen Welt. Der Einsatz von Stammzellen hat hohe Erwartungen geweckt, als eine neue potenzielle Therapiemethode die Herzfunktion nach dem Herzinfarkt verbessern zu können. Obwohl klinische und experimentelle Studien bereits einen günstigen Einfluss von Stammzellen aus dem Knochenmark auf die Herzfunktion gezeigt haben, ist deren Wirkungsmechanismus noch unklar. Die parakrine Schutzwirkung durch verschiedene Zytokine, die von Stammzellen freigesetzt werden, ist wahrscheinlicher als eine direkte Umwandlung in Herzmuskelzellen. Die protektive Wirkung von Östrogen auf das Herz-Kreislauf-System ist seit Jahren bekannt. Neue Ergebnisse deuten darauf hin, dass Östrogenrezeptoren für die Funktion der Stammzellen, die bei der kardialen Reparatur beteiligt sind, eine wichtige Rolle spielen. Die Progenitorzellen, die im Herz zu finden sind, exprimieren den Oberflächenmarker c-kit und werden wahrscheinlich aus dem Knochenmark nach dem akuten Herzinfarkt mobilisiert. Das Ziel dieser Arbeit war zu erklären, welche Rolle der Östrogenrezeptor alpha für die Funktion der Progenitorzellen-c-kit+ Zellen aus dem Knochenmark nach dem Herzinfrakt hat. Dafür wurde ein Herzinfarkt-Versuchsmodell an männlichen Wistar Ratten angewandt und eine Methode entwickelt, die MACS (Magnetic Activated Cell Sorting) und FACS (Fluorescent Activated Cell Sorting) Technologie kombiniert, um c-kit+ Zellen aus dem Knochenmark zu isolieren. Sieben Tagen nach dem Herzinfarkt stieg der prozentuelle Anteil der isolierten c-kit+ Zellen aus dem Knochenmark auf das 2.11fache an. Die c-kit+ Zellen haben in der Zellkultur durch parakrine Schutzwirkung Apoptosis von adulten Kardiomyocyten gehemmt. Weiterhin zeigten c-kit+ Zellen aus dem Knochenmark sowohl Intrazellulär- als auch Oberflächenxpression von Östrogenrezeptoren alpha (ERα). Mittels FACS- Technologie und auf Grund der Extrazellulärexpression von ERα wurde die c-kit+ Zellpopulation in c-kit+ERα- und c-kit+ERα+ Zellen aufgeteilt. c-kit+ERα+ Zellen zeigten eine verbesserte Schutzwirkung auf das Überleben von adulten Kardiomyocyten in der Zellkutur als die c-kit+ERα-. Zusätzlich wurden die Überstände von c-kit+ERα+ oder c-kit+ERα- Zellen nach 48 Stunden ins periischämischen Myokard von Ratten unmittelbar nach dem Herzinfarkt eingespritzt. Im Vergleich zu dem Effekt des Überstands von c-kit+ERα- Zellen, führte die Injektion des Überstands von c-kit+ERα+ zu einer Verbesserung der systolischen und diastolischen linksventrikulären Funktion. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass c-kit+ERα+ Zellen ein erhöhtes Potenzial für Ausschüttung von kardioprotektiven Zytokinen haben. Dies wurde mittels real- time PCR bestätigt. c-kit+ERα+ zeigten eine erhöhte mRNA Expression von IL-6 und IL-10 und eine geringere mRNA Expression von IL-11. Weiterhin wurde durch Neutralisierung von IL-6 in der Zellkultur der kardioprotektive Einfluss von c-kit+ Zellen auf den Kardiomyocyten völlig aufgehoben, während die Neutralisierung von IL-10 die Apoptosis von Kardiomyocyten nicht beeinflusst hat. Außerdem war nach einem Herzinfarkt die Produktion von Zytokinen in c-kit+ Zellen vermindert, welche sich aber nach die 17β-Östradiol Stimulierung wieder erhöhen ließ. Schließlich wurde die c-kit+ERα+ Zellpopulation auch in humanem peripheren Blut entdeckt und bestätigt, dass ERα-kontrollierte IL-6 Produktion von auch in humanen c-kit+ Zellen stattfindet. Im Gesamten zeigen diese Ergebnisse einen neuartigen kardioprotektiven Mechanismus, den c-kit+ Progenitorzellen über eine ERα-abhängige Hochregulation von IL-6 vermitteln.