Development of a transgenic animal model for measurement of intra-cellular ATP

Abstract

Mitochondriopathies are a group of clinically heterogeneous, mostly hereditary multisystemic disorders based on a deficient mitochondrial supply of ATP. Tissues with high energy demand, such as the brain or muscles, are predominantly affected. Symptoms include epileptic seizures, ataxia or muscle weakness. The underlying pathomechanisms are still not completely understood. In this context, the measurement of compartment-specific ATP levels represents an interesting approach. My doctoral thesis deals with the question whether the detection and quantification of intra-mitochondrial ATP in situ by means of the luciferase reaction would be possible. To explore this, I designed a gene construct containing the luciferase gene plus a mitochondrial targeting sequence and the antigenic fusion peptide FLAG™-tag. Additionally, I added the Shine-Dalgarno sequence, necessary for translation in prokaryotes, and the Kozak consensus sequence including the eukaryotic start codon. The gene sequence of interest was inserted into the plasmid pENTR1A_DS. This vector is part of the Gateway® Recombination System, a cloning tool based on the site- specific recombination pathway of the bacteriophage lambda being independent of appropriate restriction enzyme sites. This considerably facilitates cloning of fragments into different vector systems. I generated a vector for mammalian cell lines, (pcDNA3.2/V5_cox8a-flag-luc) and a targeting vector designed to insert the construct into the ROSA26 locus of the mouse (pROSA26_cox8a-flag- luc). I verified that transfection of HEK293 cells with the pcDNA3.2/V5_cox8a- flag-luc vector resulted in protein translation of a protein of about 70 kDa. By means of immunofluorescence, I identified the localization of the protein as intra-mitochondrial. I was able to confirm the functionality of the luciferase protein in transfected HEK293 and COS1 cells by means of a luciferin-luciferase assay. A luminometer detects the light emission in relative light units. Increasing amounts of the substrate luciferin led to a rise in light intensity. The second vector (pROSA26_cox8a-flag-luc) was constructed for the generation of a knock-in animal model with constitutive intra-mitochondrial luciferase expression. The transgenic mouse model will serve in future studies to bring forward the understanding of the pathomechanisms of mitochondriopathies.

Mitochondriopathien sind eine Gruppe klinisch heterogener, meist genetisch bedingter Multi-System-Erkrankungen, die auf einer eingeschränkten mitochondrialen Adenosintriphosphat (ATP)-Bereitstellung beruhen. Gewebe mit hohem Energiebedarf wie das Gehirn oder die Skelettmuskulatur sind vorrangig betroffen, Symptome wie epileptische Anfälle, Ataxie und Muskelschwäche sind häufig. Die zu Grunde liegenden Pathomechanismen sind bei weitem nicht vollständig verstanden. In diesem Kontext wäre die Messung kompartiment- spezifischer ATP-Spiegel ein interessanter Ansatz. Die vorliegende Dissertation behandelt die Fragestellung, ob die Erfassung und Quantifizierung des intramitochondrialen ATPs in situ mittels der Luciferase-Reaktion möglich ist. Dafür habe ich ein Genkonstrukt entworfen, welches aus dem Luciferase-Gen mit einer mitochondrialen Ziel-Sequenz besteht. Zusätzlich enthält das Konstrukt die kodierende Sequenz für das FLAG™-tag Peptid, welches den Nachweis des Konstruktes mittels eines spezifischen Antikörpers verbessert. Ausserdem fügte ich die Shine-Dalgarno-Sequenz, die für die optimale Translation in Prokaryoten erforderlich ist, und die Kozak-Sequenz, die das eukaryotische Startcodon beinhaltet, ein. Die Gensequenz wurde in das Plasmid pENTR1A_DS eingebracht. Dieser Vektor ist Teil des Gateway® Recombination Systems, einer Klonierungs-Methode, die sich des Mechanismus der ortsspezifischen Rekombination des Bakteriophagen lambda bedient. Dadurch ist die Klonierung des interessierenden Gens in verschiedene Vektor-Systeme deutlich einfacher. Ich erstellte sowohl einen Vektor zur Transfektion von Säugetier-Zellkulturen (pcDNA3.2/V5_cox8a-flag-luc), als auch einen Vektor zur Insertion des Konstruktes in den ROSA26-Locus muriner embryonaler Stammzellen (pROSA26_cox8a-flag-luc). Die Ergebnisse zeigen, dass die Transfektion von HEK293-Zellen mit pcDNA3.2/V5_cox8a-flag-luc zu einer Genexpression eines Proteins der Größe 70 kDa führt. Mittels Immunfluoreszenz konnte ich das Protein intra-mitochondrial lokalisieren. Die Funktionsfähigkeit des Proteins, welches als das Enzym Luciferase unter Anwesenheit von Luciferin und ATP Licht emittiert, konnte ich in transfizierten HEK293- und COS1-Zellen mittels des Luciferase-Assays nachweisen. Ein Luminometer erfasste die Licht-Emission in relativen Licht-Einheiten. Die Zufuhr steigender Mengen an Substrat (Luciferin) führte zu einer Erhöhung der Licht-Intensität. Ich entwickelte den zweiten Vektor, pROSA26_cox8a-flag-luc, für die Generierung eines knock-in Tiermodells mit konstitutiver, intra-mitochondrialer Luciferase-Expression. Das transgene Maus-Modell kann zum besseren Verständnis der Pathomechanismen von Mitochondriopathien beitragen.