Entwicklung und Etablierung verschiedener Nachweisverfahren für Clostridium botulinum und aktiver Toxinnachweis mit ELISA-Verfahren in unterschiedlichen Lebensmittelmatrizes sowie Untersuchungen zur Stabilität der Toxine

Abstract

Clostridium (C.) botulinum ist ein gram-positives, stäbchenförmiges, obligat anaerob lebendes Bakterium, das ubiquitär in Boden, Wasser oder Sedimenten vorkommen kann. Das Bakterium kann bei ungünstigen äußeren Bedingungen Endosporen bilden, welche über einen sehr langen Zeitraum überleben können. C. botulinum ist ein Intoxikationserreger, der lebensmittelbedingte Erkrankungen verursachen kann. Die Erkrankung Botulismus führt bei Menschen und Tieren zur Paralyse, einer symmetrisch absteigenden Lähmung. Ursache für diese Symptome sind die Botulinumneurotoxine (BoNT), die zu den gefährlichsten bekannten Toxinen zählen. Es gibt insgesamt 7 serologisch unterscheidbare Neurotoxine (BoNT Typ A bis G), davon sind 4 humanpathogene Toxintypen bekannt (A, B, E und F), die anderen Toxintypen verursachen Botulismus bei Tieren z.B Pferden, Rindern und Vögeln. Die Standard-Methode für den aktiven Toxinnachweis ist der Mäuse-Bioassay, welcher allerdings sehr zeitaufwendig und teuer ist und aus tierrechtlichen Gründen nicht immer vertretbar ist. Ziel dieser Arbeit war es, schnelle und effiziente kulturelle Nachweismethoden für die Bakterien mit Hilfe molekular- und mikrobiologischer Verfahren sowie einen aktiven Toxinnachweis in verschiedenen Lebensmittelmatrizes zu entwickeln. Aus diesem Grund wurden verschiedene PCR-Verfahren ausgewählt für den Nachweis der Toxingene sowie ein spezifischer Enzyme-Linked-Immunosorbent Assay (ELISA). Das ELISA-Verfahren wurde zur Testung in unterschiedlichen Lebensmittelmatrizes verwendet und es erfolgten Untersuchungen zur Stabilität von BoNT bei verschiedenen lebensmittelrelevanten Temperatur-Zeit Relationen und zur Stabilität der Toxine bei Lagerungstemperaturen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigten, dass alle humanpathogenen Toxintypen von C. botulinum durch lebensmittelrelevante Erhitzungsprozesse denaturiert werden konnten und dass die Stabilität der Toxine bei einer Lagerungstemperatur von +4°C im Gegensatz zur Lagerung bei -21°C rasch abnimmt. Eine aktive Toxinproduktion durch die vegetativen C. botulinum-Stämme konnte ebenfalls mit Hilfe des ELISA- Verfahrens in unterschiedlichen Lebensmitteln nachgewiesen werden.

Clostridium (C.) botulinum is a gram-positive, rod-shaped, obligate anaerobic bacterium that can ubiquitously found in soil, water or sediment. The bacteria can form endospores under adverse external conditions, which can survive for a very long period of time. C. botulinum is an intoxication pathogen which can cause primarily foodborne diseases. The disease botulism leads in humans and animals to a symmetrical descending paralysis. Cause of these symptoms are the botulinum neurotoxins (BoNT), which are released into the body. C. botulinum can form an extremely potent neurotoxin, which is one of the most dangerous toxins known. There are a total of 7 serologically distinct botulinum neurotoxins (BoNT type A to G), 4 toxin types (A, B, E and F) are known as human pathogens the other toxintypes causing botulism in animals such as horses, cattle and birds. The standard method for the detection of active toxin is the mouse bioassay, which is very time-consuming and expensive and from animal issues is not always justifiable. The aim of this work was to develop fast and efficient detection methods for the bacteria using molecular and microbiological methods as well as an active toxin detection method in different food matrices. For this reason, various PCR methods were selected for the detection of toxin genes and a specific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established for the active toxin proof. The ELISA method was used for testing in different food matrices and also studies on the stability of BoNT with different food-relevant temperature-time relations and the stability of the toxins at storage temperatures. The results of this study showed that all pathogenic toxin types of C. botulinum could be denatured by heating in food-related processes and the stability of the toxins decreases quickly at a storage temperature of +4 °C, in contrast to storage at -21° C. An active toxin production by vegetative strains of C. botulinum in different food samples could also be detected using the ELISA method.