Assessment of the effects of the probiotic Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) on the immune defense of piglets in vivo and in vitro in the context of microbial infections

Abstract

The main objective of the present study was to assess the immunological effects of the probiotic Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) in piglets using two different approaches. Firstly, we used an in vivo model, where piglets in a probiotic (43 piglets receiving E. faecium SF68 supplement) and a control group (46 piglets without the probiotic supplement) were infected with Salmonella typhimurium DT104. Piglets from each litter were randomly selected and sacrificed 3h, 24h and 72h and 28d post infection (p.i) and PBMC, CD4+ lymphocytes from spleen and discrete Peyer´s patch (PP), lymphocytes from distal continuous PP and CD8+ lymphocytes from the intraepithelial lymphocytes (IEL) of the jejunum were isolated using different protocols and a magnetic cell sorting (MACS) method. The relative percentages of CD8+ lymphocytes in the IEL of both groups as compared by FACS analysis showed, in line with previous studies, a significant decrease in CD8+ lymphocytes in the probiotic group 24h after Salmonella infection. The relative percentages of CD4+ cells in the discrete PP and the spleen showed a tendency towards higher percentages in piglets of the probiotic group. From all the cells isolated, RNA samples were extracted and complementary DNAs (cDNAs) were prepared. From the cDNAs of the PBMC samples and that of the distal PP samples, gene expression analysis for various cytokines/chemokines, and receptors was undertaken by real-time PCR. Analysis revealed a significant up-regulation of the genes for TLR2, IL-1, IL-1ß and IL-8, in the PBMC and IL-1, in the distal continuous PP of piglets of the probiotic group 71h after Salmonella infection. Although inflammation could not be minimized, our study is the first to report the up- regulation of the anti-inflammatory genes TLR9, CD9 and TGF-ß through the probiotic E. faecium SF68. Secondly, we used an in-vitro model to study the immunological effect of E. faecium SF68 against transmissible gastroenteritis virus (TGEV) in epithelial cells. This work is the first to study the effect of probiotics against TGEV. Since probiotics act mainly in the intestine where TGEV-infection resides, establishing appropriate intestinal cell lines of porcine origin is crucial. For this purpose two previously isolated cells (type I and type II cells) from the epithelium of piglets were characterized morphologically (light and transmission electron microscopy (TEM), FACS) histochemically (FACS and fluorescence Microscopy), molecularly (RT-PCR) and with respect to their sensitivity to TGEV infection. Our results indicate that the cells are of epithelial nature and that only type II cells are sensitive to TGEV. Type II cells were found to produce higher virus titres than the known model cells for studies on TGEV, ST cells, which do not originate from the intestine. Thus, type II could be used as appropriate porcine intestinal epithelial cell lines for in vitro studies with TGEV. To study the anti-viral effect of the probiotic on TGEV, monolayers of type II cells were pre-treated with E. faecium SF68 before infection with the virus and cellular survival rates determined using an MTT test. It was revealed that both probiotic bacteria and their metabolic products in culture supernatant enhanced cellular survival against TGEV infection. Furthermore, we measured the viral titres of the probiotic-treated and non-treated TGEV-infected monolayers of type II cells using the TCID50 titration method on ST cells. Our results showed a decrease in the viral infectivity and viral yields as a result of E. faecium SF68-pretreatment. In-order to confirm the molecular out comes of the protective effect of the probiotic pre-treatment, we did real-time PCR analysis to compare the levels of expression of the genes for IL-6, IL-8 and IFN- between the control type II cells, the cells pre-treated with the probiotic, the cells that were infected with TGEV and the cells that were probiotic pre-treated and infected with TGEV. Our results show a highly significant up-regulation of the above genes by viral infection as compared to that attributed to the probiotic-pre-treatment. As a result of decreased virus yields, a significant decrease in the virus-induced up-regulation of the above inflammatory genes was observed after E. faecium SF68 pre-treatment. The results suggest a possible mechanism of beneficial effects of probiotics to intestinal infections through a reduction of inflammatory cytokines induced by infecting agents, including viruses.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, durch zwei verschiedene Vorgehensweisen die immunologischen Effekte des probiotischen Stammes Enterococcus faecium SF68 (NCIMB 10415) auf Ferkel einzuschätzen. Zunächst wurde ein in vivo Modell genutzt, bei dem die Ferkel in zwei Gruppen – eine probiotische (43 Ferkel, die als Präparat den Stamm E. faecium SF68 verabreicht bekamen) und eine Kontrollgruppe (46 Ferkel ohne probiotisches Präparat) – eingeteilt wurden. Beide Gruppen wurden mit dem Stamm Salmonella typhimurium DT104 infiziert. Zufällig ausgewählte Ferkel jeden Wurfs wurden 3, 24 und 72 Stunden sowie 28 Tage post infectionem (p. i.) getötet. PBMC, CD4+-Lymphocyten aus der Milz und einzelnen Peyer’sche Plaques (PP), Lymphocyten aus dem distalen PP und CD8+-Lymphocyten aus den intraepithelialen Lymphocyten (IEL) des Jejunums wurden durch Einsatz verschiedener Protokolle und des Magnetic Cell Sorting Prinzips (MACS) isoliert. Durchflußzytometrische Bestimmung der CD8+-Lymphocyten im IEL aus Ferkeln beider Versuchsgruppen ergab im Einklang mit früheren Untersuchungen eine signifikante Reduktion in der probiotischen Gruppe 24 Stunden nach Infektion mit Salmonellen. Die relative Anzahl von CD4+-Zellen in den einzelnen PP und der Milz war tendetiell höher in Ferkeln der probiotischen Gruppe. Aus allen isolierten Zellen wurde RNA gewonnen und komplementäre DNA (cDNA) hergestellt. Mit der cDNA aus den Proben der PBMC und aus dem distalen PP wurde eine real-time PCR durchgeführt, um die Genexpression verschiedener Cytokine/Chemokine und Rezeptoren zu überprüfen. Unsere Ergebnisse zeigten eine signifikante Hochregulation der Gene für TLR2, IL-1, IL-1ß und IL-8 in den PBMC und IL-1 in den distalen PP der Ferkel aus der probiotischen Gruppe 71 Stunden nach Infektion mit Salmonellen. Obwohl die Entzündungsreaktion nicht vermindert werden konnte, wird hier erstmals die Hochregulation der antientzündlichen Gene TLR-9, CD9 und TGF-ß durch den probiotischen Stamms E. faecium SF68 gezeigt. Im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurde ein in-vitro Modell genutzt, um die immunologischen Auswirkungen des Stammes E. faecium SF68 auf die vermerung des Transmissiblen Gastroenteritis-Virus (TGEV) in Epithelzellen zu untersuchen. Diese Arbeit ist die erste, die den Effekt eines Probiotikums gegen TGEV erforscht. Da Probiotika hauptsächlich im Darm wirken, also dort, wo sich TGEV-Infektionen etablieren, ist der Einsatz einer adäquaten intestinalen Zelllinie porcinen Ursprungs entscheidend. Daher wurden zwei früher isolierte Zelllinien (Typ I- und Typ II-Zellen) aus dem Epithel von Ferkeln durch Einsatz morphologischer (Licht- und Transmissionselektronenmikroskop, FACS), histochemischer (FACS und Fluoreszenzmikroskopie) und molekularer (RT-PCR) Methoden sowie hinsichtlich ihrer Sensitivität gegenüber TGEV charakterisiert. Die erzielten Ergebnisse lassen vermuten, dass beide Zelllinien epithelialer Natur sind und nur die Typ II-Zellen mit TGEVinfiziert werden können. Typ II-Zellen produzierten höhere Virustiter als ST-Zellen, die das für Untersuchungen zu TGEV etablierte Zelllinien-Modell darstellen, aber ursprünglich nicht aus dem Darm stammen. Folglich können Typ II-Zellen künftig als adäquate porcine Epithelzelllinie für in-vitro Untersuchungen von TGEV genutzt werden. Um den antiviralen Effekt des Probiotikums auf TGEV zu untersuchen, wurden Monolayer der Typ II-Zellen vor der Infektion mit dem Virus mit dem Stamm E. faecium SF68 vorbehandelt. Anschließend wurde der Anstieg überlebender Zellen mittels MTT-Test ermittelt und mit den Ergebnissen der nicht vorbehandelten Kontroll-Monolayern verglichen. Zusätzlich wurden die Virustiter der probiotisch vorbehandelten und nicht vorbehandelten infizierten Monolayer der Typ II-Zellen durch Einsatz der TCID50 Titrationsmethode von ST-Zellen bestimmt. Die Ergebnisse zeigen einen Abfall der viralen Aktivität und der Virustiter als Resultat der Vorbehandlung mit dem Stamm E. faecium SF68. Um die molekularen Ergebnisse der Schutzeffekt vom Probiotika gegenüber TGEV infektion zu bestätigen, wurde eine real-time PCR-Analyse durchgeführt, um den Grad der Genexpression von IL-6, IL-8 und IFN- zwischen den Typ II-Kontrollzellen, probiotisch vorbehandelten Zellen, mit TGEV infizierten Zellen und Zellen, die sowohl probiotisch vorbehandelt als auch mit TGEV infiziert wurden, zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen, dass durch die virale Infektion die Expression der oben erwähnten Gene verglichen mit der Expression in der probiotisch vorbehandelten Gruppe stark signifikant hochreguliert werde. Die virus-induzierte Hochregulation der oben erwähnten Gene für Entzündungfaktoren ließ sich durch Vorbehandlung mit dem Stamm E. faecium SF68 reduzieren. Die Ergebnisse deuten drauf hin, dass die nützlichen Effekts des Probiotikums in einer Reduktion der Entzündungszytokinen liegt, die durch infektiöse Agentien hervorgerufen werden.