Expression von Genen des Endothelin-, Renin-Angiotensin- und Stickstoffmonoxidsystems in Mäusen mit Endothelin-Typ B-Rezeptor-Defizit

Abstract

Das Endothelinsystem hat für die physiologische Funktion der Niere als auch für die Entstehung von Nierenerkrankungen eine große Bedeutung. Endothelineffekte an Nierenarterien und –arteriolen werden über zwei Rezeptortyen, den Endothelinrezeptor Typ A (ETA) und Typ B (ETB) vermittelt. Der Beitrag dieser Rezeptortypen zu den Endothelinwirkungen ist auch aufgrund begrenzter Selektivität von Rezeptoragonisten und -antagonisten nicht vollständig bekannt. Im Rahmen eines Projektes, das sich mit den Wirkungen von Endothlin auf die Nierendurchblutungsregulation beschäftigt, wurde in der vorliegenden Arbeit un-tersucht, welchen Einfluß ein ETB-Rezeptor-Defizit auf die Expression von Komponenten des Endothelin-, Renin-Angiotensin- und Stickstoffmonoxidsystems in präglomerulären Gefäßen hat. Diese Systeme sind entscheident an der Regulation der Nierendurchblutung beteiligt und interagieren auf systemischer und zellulärer Ebene. Die Experimente wurden an ETB-Rezeptor-defizienten Mäusen und Wildtypen durchgeführt. Bei den ETB- Rezeptor-defizienten Mäusen handelte es sich um ein „rescue“-Modell, bei dem im sympathischen Nervensystem ETB-Rezeptoren se-lektiv exprimiert werden, um die Ausbildung eines Megakolons zu vermeiden. Genexpressionen wurden auf mRNA- Ebene mittels real time PCR und auf Protein-ebene mittels Western Blot analysiert. Zur Isolation präglomerulärer Gefäße diente eine modifizierte Eisenoxid-Sieb-Technik. Ein möglicher Effekt des Eisenoxids auf die Gefäße, insbesondere auf die Endothelschicht, wurde in zwei Modellen untersucht. Aortenringe von Mäusen, die eine Perfusion mit oder ohne Eisenoxid erhielten, wurden unter isometrischen Bedingungen hinichtlich ihrer endothelabhängigen Dilalation durch Azetylcholingabe untersucht. Die mRNA-Expression der endothelialen Markergene endotheliale Stickoxidsynthase (eNOS), PECAM-1 und Endothelin-1 wurde in beiden Gruppen gemessen. Histologische und immunhistologische Methoden dienten der Beurteilung des Nierengewebes dieser Tiere. Die Dilatation der Aorta als auch die Expression der Markergene unterschieden sich nicht wesentlich zwischen beiden Gruppen. Hämatoxylin- Eosin-Schnitte, Semi-Dünnschnitte und PECAM-1 (CD31) Immunfärbungen des Nierengewebes weisen auf ein intaktes Endothel nach Eisenoxidperfusion hin. ETB-Rezeptor-defiziente Mäuse zeigten eine geringere ETA-Rezeptorexpression in den präglomerulären Gefäßen (mRNA) und gesamten Nierengewebe (mRNA und Protein mittels Western Blot) im Vergleich zu den Wildtypen. Das Endothelinprotein war im Nierengewebe erhöht. Die eNOS-mRNA war in den präglomerulären Gefäßen der ETB-Rezeptor-defizienten Mäuse vermindert, jedoch nicht in der gesamten Niere. Die mRNA-Mengen von neuronaler NOS (nNOS), induzierbarer NOS (iNOS), Angiotensin Typ 1A Rezeptor (AT1A) und Typ 2 Rezeptor (AT2) wurden ausschließlich im gesamten Nierengewebe gemessen und differierten zwischen den Gruppen nicht. Die Arbeit zeigt, dass die verwendete Isolationsmethode mittels Eisenoxid keine wesentlichen Auswirkungen auf das Gewebe hat und für die Genexpressionsanalyse geeignet ist. ETB-Rezeptordefizit geht mit Änderungen der Genexpression des Endothelin- und Stickstoffmonoxidsystems einher. Die fehlende Clearence-Funktion bei Fehlen des ETB-Rezeptors führt zum Anstieg der Endothelin-1 (ET-1)-Konzentration. Dies ist eine Ursache verminderter ETA- Rezeptorexpression. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie weisen auf deutliche Änderungen der Genexpression im Endothelinsystem und der eNOS von Nieren ETB-Rezeptor-defizienter Mäuse hin. Diese Kenntnisse sind für die Interpretation funktioneller Untersuchungen an ETB-Rezeptor-defizienter Mäusen von Bedeutung. Sie zeigen zugleich, dass selektiver Gen–knock out zu umfangreichen Veränderungen der Genexpressionen und damit zur Modulation physiologischer Funktionen führt.

The aim of the study was to determine the influence of endothelin type B receptor (ETB) deficiency on the expression of endothelin 1 (ET-1), endothelin type A receptor (ETA), nitric oxide synthases (NOS) and angiotensin receptors (AT) in preglomerular vessels and kidneys of ETB(-/-) mice. ET-1 is involved in the control of renal vessels by acting on ETA and ETB. The contribution of these receptors to constrictor and dilator actions of ET-1, and their signaling is not completely clear. Further, several studies indicate an interaction of ET-1 with the angiotensin system; which includes modulation of receptor expression. The rescued ETB receptor deficient mouse (ETB(-/-)) might be a useful tool for investigation of ET receptor function. To achieve the aim renal microvessels (preglomerular arterioles) of ETB(-/-) mice and ETB(+/+) mice were isolated using a combined iron oxid-sieve technique. A damaging effect of the iron oxide perfusion on microvessel morphology and endothelial cells was excluded by functional and histological investigations. The ET-1 protein was stronger expressed in the kidneys of ETB(-/-) compared to wild type mice (ETB(+/+)). ETA mRNA expression was decreased in preglomerular vessels. ETA mRNA and protein were also diminished in whole kidney preparations in ETB(-/-) mice. The endothelial NOS (eNOS) mRNA was less expressed in preglomerular vessels. No significant differences were found for mRNA expression of eNOS, nNOS, and iNOS in whole kidney preparations. AT1 and AT2 receptor mRNA in the kidney did not differ between ETB(-/-) and ETB(+/+). The results of ET-1 and ETA expression confirm earlier findings of a clearance function of the ETB receptor and modulation of ETA expression by ET-1. ETB receptor expression/function seems to influence eNOS mRNA expression in renal arterioles. There is no influence of ETB receptor deficiency on AT receptor mRNA expression. The study shows that ETB deficiency goes along with a differential expression of components of the endothelin system and also of the eNOS. This has to be taken into consideration when using the model for functional investigations of vessels.