Interaction of estrogen receptors and the TGF-ß signal transduction pathway: impact on migration of human breast cancer cells

Abstract

In mammals estrogens play a crucial role in a wide range of physiological processes, such as reproduction and behaviour; however, they are also involved in the development and progression of diseases. Thus, they are considered as risk factors for tumourigenesis for instance in the breast epithelium and endometrium. In their capacity to regulate development and function of reproductive organs, estrogens are often committed to interactions with growth factors, especially insulin-like growth factor-1. Similar correlations have been suggested for the transforming growth factor-β (TGF-β); however, there exists only little information regarding this question. As TGF-β exerts positive as well as negative influences on cancer cells, it is considered as both promoter and suppressor of tumour progression. During cancer development, cells become less sensitive to the antiproliferative and proapoptotic effects of the chemokine. Concomitantly, the tumour promoting properties, like induction of epithelial-to-mesenchymal transition and cell migration, gain in importance, which substantially account for the metastatic dissemination of a tumour. In this study the cross-communication between estrogens and TGF-β has been investigated, particularly focussing on its impact on the migratory properties of TGF-β. Both, 17-β-estradiol (E2) and TGF-β, induced migration of estrogen dependent MCF-7 breast cancer cells, and simultaneous treatment resulted in a synergistic effect of the migratory response. In contrast, the ability of TGF-β to evoke chemotaxis was drastically diminished when the cells were preincubated with E2, but also the pure antiestrogen ICI182,780. E2 seems to be a specific inhibitor of TGF-β induced chemotaxis, since the non-specific migratory stimulus of serum was not affected. Abrogation of Smad-signalling proved that this pathway is essential for TGF-β mediated migration of MCF-7 cells. In agreement, pretreatment of these cells with E2 resulted in a reduced activation of the Smad signalling cascade. Experiments with membrane impermeable E2 and pertussis toxin clearly proved the inhibitory effect of E2 on the TGF-β pathway to be mediated by a Gi-protein coupled estrogen responsive receptor located at the plasma membrane. Transfection experiments provide evidence for the orphan G-protein coupled receptor GPR30 as a mediator of E2 induced interruption of TGF-β signalling. Thus, migration and Smad2 phosphorylation of E2 sensitised MCF-7 cells could be restored after down- regulation of GPR30 expression by siRNA technique. These findings could be corroborated, as the inhibitory properties of the hormone on TGF-β signalling could be established by transfection of GPR30 deficient MDA-MB-231 cells with a GPR30 expression vector. Activation of ERK-MAPK is a critical event in signalling via GPR30. In MCF-7 cells, ERK1/2 was rapidly activated in response to E2 and ICI182,780, whereas in MDA-MB-231 cells activation of the enzyme could only be measured after over-expression of GPR30. Moreover, costimulation of MCF-7 cells with TGF-β and E2 activated ERK1/2 in a synergistic manner. Interruption of the MAPK pathways proved that ERK1/2 activation is a critical event in the impairment of TGF-β signalling by E2.

Estrogene spielen eine wichtige Rolle bei einer Vielzahl physiologischer Prozesse, wie Fortpflanzung und Verhalten, sind aber auch bei Entstehung und Fortschreiten pathologischer Prozesse beteiligt. So gelten sie z.B. als Risikofaktoren für die Entwicklung von Tumoren z.B. im Brustepithelium und Endometrium. Die Fähigkeit von Estrogenen, die Entwicklung und Funktion von Reproduktionsorganen zu regulieren, beruht zu einem großen Teil auf Wechselwirkungen mit Wachstumsfaktor-Signalwegen, besonders mit dem Insulin- ähnlichen Wachstumsfaktor-1 (IGF-1). Ein ähnlicher Zusammenhang wird auch für den transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) vermutet, jedoch ist dazu bisher nur sehr wenig bekannt. TGF-β vermittelt sowohl positive als auch negative Einflüsse auf Tumorzellen und wird deshalb als Tumorpromotor, aber auch -suppressor angesehen. Mit fortschreitender Tumorentwicklung verlieren die Zellen ihre Sensitivität für die antiproliferativen und proapoptotischen Effekte von TGF-β, während seine Tumor-fördernden Eigenschaften an Bedeutung gewinnen. Dazu gehört die Induktion von EMT (epithelial-to-mesenchymal transition) und Zellmigration, die wesentlich zur metastatischen Verbreitung von Tumorzellen beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Wechselwirkungen zwischen Estrogenen und TGF-β und deren Einfluss auf die migratorischen Eigenschaften des Wachstumsfaktors untersucht. Sowohl 17-β-estradiol (E2) als auch TGF-β stimulierten die Migration von estrogen- abhängigen MCF-7-Zellen, gleichzeitige Gabe der Substanzen führte zu einem synergistischen Effekt. Im Gegensatz dazu verringerte eine Vorbehandlung der Zellen mit E2, aber auch dem reinen Antiestrogen ICI182,780, die migratorische Wirkung von TGF-β signifikant. Der inhibitorische Einfluss von E2 auf die Zellmigration scheint spezifisch für TGF-β zu sein, da das Steroid keine Wirkung auf den unspezifischen Stimulus von fetalem Kälberserum zeigte. Durch Smad4-Knockdown konnte gezeigt werden, dass der Smad-Signalweg maßgeblich an der Vermittlung der migratorischen Eigenschaften von TGF-β beteiligt ist. In Übereinstimmung damit, greift E2 bereits auf der Ebene der Smad-Aktivierung in den TGF-β-Signalweg ein. Experimente mit Membran-impermeablem E2 und Pertussis Toxin bewiesen, dass dieser Estrogeneffekt von einem Membran-ständigen, Gi- Protein-gekoppelten Rezeptor vermittelt wird. Transfektionsexperimente bewiesen, dass der G-Protein-gekoppelte Rezeptor GPR30 an der Vermittlung der Interaktion von TGF-β und Estrogenen beteiligt ist. So konnte durch Hemmung der GPR30-Expression mittels siRNA der TGF-β-Signalweg in E2-behandelten MCF-7-Zellen wiederhergestellt werden. Darüber hinaus führte eine Überexpremierung des Rezeptors in GPR30-defizienten MDA-MB-231-Zellen zur Etablierung eines Estrogen-sensitiven Phänotyps. Die Aktivierung der ERK-MAPK spielt eine zentrale Rolle in vielen GPR30-vermittelten Effekten. E2 und ICI182,780 stimulierten ERK1/2 in MCF-7-Zellen, während eine Enzymaktivierung in MDA-MB-231-Zellen dagegen nur nach Transfektion mit GPR30 nachweisbar war. Darüber hinaus hatte eine Kostimulation mit TGF-β und E2 eine synergistische Wirkung auf die ERK1/2-Phosphorylierung. Durch Unterbrechung des MAPK- Signalweges konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung der ERK1/2 maßgeblich zur Hemmung des TGF-β-Signalweges durch E2 beiträgt.