New drugs in prevention of experimental corneal graft rejection

Abstract

Background: Immune mediated graft rejection remains a major complication of penetrating keratoplasty (PKP), requiring more effective preventive measures. Purpose: We investigated the efficacy of selective glucocorticoid receptor agonist (SEGRA), everolimus and spironolactone on the prevention of allograft rejection in a MHC class I/II mismatch rat corneal transplant model. Methods: A total of 133 female Lewis rats underwent PKP. Syngeneic corneal grafting in 20 rats served as control for technical failure. All other 113 Lewis rats received allogeneic corneal grafts from Dark Agouti donors and were randomly assigned to receive the agent of interest, vehicle or remained untreated. ME- CD-SEGRA (0.25% SEGRA-containing microemulsion) and everolimus microemulsion (0.05 and 0.025%) were applied as topical treatment five times daily, while spironolactone suspension was given orally, 100 mg/kg/day. Therapy was applied daily for 35 days in SEGRA group and until the day of rejection in everolimus and spironolactone treated rats for graft survival analysis. Detection of immunological parameters was performed by testing mRNA expression of cytokines (IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α) and T-cell markers (CD3, CD25) at predestinated time points. Results: Topical application of ME-CD-SEGRA significantly prolonged mean survival time (MST) of corneal grafts (42.2 ± 4.0 days) compared with untreated controls (11.7 ± 1.2 days, p = 0.00003) or animals that received the vehicle only (15.0 ± 1.5 days). ME-CD-SEGRA decreased intragraft mRNA expression of all tested cytokines and T-cell marker, in particularly significant for IL-4 compared to untreated controls (p < 0.05). Local administration of 0.05 or 0.025% everolimus was effective in prolonging the MST of corneal grafts (21 ± 6.57 days and 16.4 ± 2.3 days, respectively) compared to the vehicle group (13.3 ± 1.7 days, for both p < 0.001). At the same time, increased mRNA expression of IL-10 (p = 0.015) was detected in everolimus treated grafts. Spironolactone also significantly prolonged MST of corneal grafts (14.9 ± 2.0 days) compared with both vehicle- treated (12.3 ± 1.2 days, p = 0.007) and untreated controls (13.0 ± 1.0 days, p = 0.01). Spironolactone affected both systemic (down-regulation of CD25+ mRNA expression in spleen; p < 0.01) and local immune response (up-regulation of IL-10 mRNA expression in cornea; p < 0.01). Conclusion: All tested drugs significantly prolonged corneal graft survival following experimental keratoplasty. Overall, further clinical investigations of these agents may contribute to improve the outcome of keratoplasty.

Hintergrund: Immunmediierte Abstoßungsreaktionen sind Hauptursache des Transplantat-versagens nach perforierender Keratoplastik und stellen weiterhin eine Herausforderung dar. Zielsetzung: Wir untersuchten die Effekte eines selektiven Glucocorticoidrezeptoragonisten (SEGRA) sowie von Spironolakton und Everolimus hinsichtlich der Prävention einer Transplantatabstoßung in einem Ratten-Hornhauttransplantatmodell mit diskrepanter MHC Klasse I/II. Methoden: Es wurde an insgesamt 133 weiblichen Lewis-Ratten eine perforierende Keratoplastik durchgeführt. Syngene Hornhauttransplantationen an 20 Tieren dienten als Kontrolle für technische Probleme. 113 Lewis-Raten erhielten allogene Transplantate von Dark Agouti-Spendertieren. Die Empfänger wurden randomisiert den Therapiegruppen zugeteilt, erhielten das Wirkstoffvehikel oder blieben unbehandelt. ME-CD-SEGRA (0,25% SEGRA-haltige Mikroemulsion) oder Everolimus (als 0,05% bzw. 0,025% Mikroemulsion) wurden fünf Mal täglich topisch angewandt, während Spironolakton als Suspension 100 mg/kg pro Tag oral gegeben wurde. Die Therapie wurde bei der SEGRA Gruppe über 35 Tage postoperativ appliziert. Die Behandlung mit Everolimus oder Spironolakton wurde bis zum Zeitpunkt der Transplantatabstoßung durchgeführt. Zum Monitoring immunologischer Parameter wurde die Genexpression von Zytokinen (IL-4, IL-10, IFN-γ, TNF-α) und T-Zell Markern (CD3, CD25) im Transplantat zu vorbestimmten Zeitpunkten vorgenommen. Ergebnisse: Durch topische Anwendung von ME-CD-SEGRA konnte die mittlere Überlebenszeit der Hornhauttransplantate (42,2 ± 4,0 Tage) gegenüber der unbehandelten Kontrollgruppe (11,7 ± 1,2 Tage, p = 0.00003) oder Tieren, die nur die Wirkstoffvehikel erhielten (15,0 ± 1,5 Tage) signifikant verlängert werden. ME-CD-SEGRA verminderte die mRNA-Spiegel aller untersuchten Zytokine und T-Zell-Marker, insbesondere für IL-4 gegenüber unbehandelten Tieren (p < 0.05). Die lokale Anwendung von 0,05 oder 0,025 % Everolimus verlängerte die mittlere Überlebenszeit der Transplantate (21 ± 6.57 bzw. 16,4 ± 2,3 Tage) im Vergleich zur Wirkstoffvehikel-Gruppe (13,3 ± 1,7 Tage, für beide p < 0.001). Gleichzeitig wurde eine erhöhte IL-10 mRNA Expression (p = 0,015) im Transplantat nachweisbar. Spironolakton verlängerte ebenfalls signifikant die Überlebenszeit (14,9 ± 2,0 Tage) im Vergleich zur Wirkstoffvehikel Gruppe (12,3 ± 1,2 Tage, p = 0,007) und der unbehandelten Kontrollgruppe (13,0 ± 1,0 Tage, p = 0,01). Spironolakton beeinflusste sowohl die systemische (Senkung der CD25 mRNA Expression in der Milz; p < 0,01) als auch die lokale Immunregulation (Erhöhung der IL-10 mRNA Expression in der Hornhaut; p < 0,01). Schlussfolgerung: Alle getesteten Medikamente haben das Überleben des Hornhauttransplantats nach der Keratoplastik statistisch signifikant verlängert. Hiermit verbunden besteht die Hoffnung, dass klinische Studien dieser Wirkstoffe den Erfolg nach Keratoplastik weiter vorantreiben könnten.