Identifizierung und Nachweis von tier- und gewebespezifischen Markern in tierischen Nebenprodukten und Futtermitteln zur Eindämmung der Übertragung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie (TSE)

Abstract

In der vorliegenden Arbeit werden neue analytische Methoden für den Nachweis von tierischen Proteinen in Nebenprodukten und Futtermitteln beschrieben. Aufgrund der Durchsetzbarkeit von Rechtsvorschriften zur Bekämpfung der transmissiblen spongiformen Enzephalopathie (TSE) der Europäischen Union und hinsichtlich geplanter Lockerungen dieser bedarf es dringend der Entwicklung speziesspezifischer Nachweismethoden, um insbesondere den Eintrag bovinen Materials in die Futtermittelkette zu verhindern. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung und Validierung immunologischer Methoden zum speziesspezifischen Nachweis prozessierter tierischer Proteine in Futtermitteln als Alternativmethoden zur Mikroskopie. Dafür wurden zunächst verschiedene mögliche Gewebemarker tierischen Ursprungs identifiziert und auf ihre potentielle Eignung anhand von Sequenzvergleichen und Literaturrecherchen überprüft. Aufgrund der extremen Stabilität und Hitzeresistenz, der artspezifischen Sequenzunterschiede und des reichlichen Vorhandenseins in Fleisch- und Knochenmehlen hat sich dabei das Knochenprotein Osteocalcin als besonders geeignet erwiesen und wurde daher als Zielprotein für die zu entwickelnden Nachweissysteme ausgewählt. Ein Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Entwicklung und Optimierung eines Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA), welcher die Detektion bovinen Materials ermöglichen sollte. Um dabei die Assay-Spezifität auf Rinder zu beschränken, wurden sowohl spezies- als auch sequenzspezifische polyklonale Antikörper gegen bovines Osteocalcin generiert und auf ihre Eignung getestet. In Verbindung mit einem kommerziellen gegen Osteocalcin gerichteten monoklonalen Antikörper konnte daraufhin ein Sandwich-ELISA für den Nachweis bovinen Osteocalcins entwickelt werden. Auf die Methodik des ausgearbeiteten ELISA aufbauend sollte hiernach eine real-time-immuno-PCR (RT-iPCR) als weitere Strategie für den sequenzspezifischen Osteocalcin-nachweis entwickelt werden. Dabei sollte verifiziert werden, ob eine höhere Sensitivität der Detektion bovinen Osteocalcins im Vergleich zu dem entwickelten Sandwich-ELISA erreicht werden könnte. Abschließend wurde untersucht, inwiefern ein immunologisches Detektionssystem für bovines Osteocalcin mittels Phage-Display-Methoden generierbar ist. Dafür wurde, ausgehend von einer Sequenzanalyse, eine spezifische Aminosäuresequenz bovinen Osteocalcins für die Isolierung spezifisch bindender Phagen gewählt. Isolierte Phagen mit positiver Bindungsaffinität gegen bovines Osteocalcin konnten dann in einem ELISA zum Nachweis bovinen Osteocalcins eingesetzt und anhand einer DNA-Sequenzierung das interagierende Peptid charakterisiert werden. Nach der Optimierung einzelner Arbeitsschritte wurde die Leistungsfähigkeit für die genannten Systeme untersucht. Dabei wurden die Möglichkeiten und Grenzen der entwickelten Nachweismethoden anhand von Referenzmaterialien und handelsüblichen Proben aufgedeckt. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der entwickelte ELISA, als auch die RT-iPCR den Nachweis bovinen Osteocalcins mit einer Sensitivität von 1 ng Osteocalcin bei ausgeprägter Spezifität ermöglichen. Für beide Systeme konnte außerdem eine bemerkenswerte Nachweisgrenze von 0,1 % bovinen Fleisch- und Knochenmehls in pflanzlichen Futtermitteln ermittelt werden. Dabei wurde ein bovines Fleisch- und Knochenmehl genutzt, welches sogar bei 145 °C behandelt wurde, was über den gesetzlich festgelegten Forderungen liegt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz einzelner in vitro selektierter Phagenklone in einem direkten ELISA sowohl reines bovines Osteocalcin, als auch ein hoch prozessiertes bovines Fleisch- und Knochenmehl detektiert werden konnte. Die Ergebnisse belegen die Möglichkeit des speziesspezifischen, selektiven Nachweises von tierischen Proteinen in Futtermitteln, basierend auf bekannten Osteocalcinsequenzen. Der hier beschriebene Osteocalcin-Assay könnte die Grundlage für ein validiertes Nachweisverfahren als Werkzeug für die Sicherstellung und Überprüfung der Einhaltung des Verfütterungsverbots werden und somit zu einer Verbesserung der Bekämpfung der Transmissiblen spongiformen Enzephalopathien führen. Ein weitreichender Einsatz der entwickelten ELISA- Methode für den speziesspezifischen Nachweis tierischer Proteine in Futtermitteln anderer Spezies ist denkbar.

In this work, new analytical methods for the detection of animal proteins in animal feed and by-products are described. Due to the enforcement of legislation against transmissible spongiform encephalopathy (TSE) of the European Union and of the planned relaxation of this, it needs urgent development of species-specific detection methods, in particular to prevent the entry of bovine material in the feed chain. The aim of this study was the development and validation of immunological methods for species-specific detection of processed animal proteins in feed as alternative methods of microscopy. Therefore, first a number of possible tissue markers of animal origin have been identified and tested for their potential suitability on the basis of sequence comparisons and literature searches. Due to the extreme stability and heat resistance, the species-specific differences in sequence and the abundant presence in meat and bone meal the bone protein osteocalcin has proved to be particularly suitable and was therefore selected as the target protein for the detection systems to be developed. One focus of this work was the development and optimization of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which should enable the detection of bovine material. To limit the assay specificity on cattle, both species- and sequence-specific polyclonal antibodies have been generated against bovine osteocalcin and tested for their suitability. In combination with a commercial monoclonal antibody directed against osteocalcin a sandwich ELISA for the detection of bovine osteocalcin has been developed. Based on the methodology of the elaborated ELISA, a real-time immuno-PCR (RT-iPCR) should be developed as another strategy for sequence-specific detection of osteocalcin. It should be verified whether a higher sensitivity of the osteocalcin-detection compared to the developed sandwich ELISA might be achieved. Finally, it was investigated whether an immunological detection system for bovine osteocalcin is developable using phage display methodology. Therefore, based on a sequence analysis, a specific amino acid sequence of bovine osteocalcin was chosen for the isolation of specifically binding phage. Isolated phage with positive binding affinity against bovine osteocalcin were used in an ELISA for the detection of bovine osteocalcin and the interacting peptide was characterizes by the use of DNA sequencing. After optimization of individual work steps, the efficiency for those systems was verified. The possibilities and limitations of the developed detection methods based on reference materials and commercial samples were investigated. It could be demonstrated, that both the developed ELISA, as well as the RT-iPCR enable the detection of bovine osteocalcin with a sensitivity of 1 ng osteocalcin with distinctive specificity. For both systems a remarkable detection limit of 0.1 % bovine meat and bone meal could be determined in plant feed. Therefore a bovine meat and bone meal was used, which was even treated at 145 °C, which is above the statutory requirements. Moreover, it was demonstrated that due to the use of individual in vitro selected phage clones in a direct ELISA both pure bovine osteocalcin, as well as a high processed bovine meat and bone meal could be detected. The results demonstrate the possibility of species-specific, selective detection of animal proteins in animal feed, based on known osteocalcin sequences. The described osteocalcin assay could be the basis for a validated detection method for ensuring the compliance of the feed ban and therefore lead to an improvement in the fight against transmissible spongiform encephalopathy. A far-reaching application of the developed ELISA method for the species-specific detection of animal proteins in feed for other species is possible.