dc.contributor.author
Kreuz, Grit
dc.date.accessioned
2018-06-07T19:02:31Z
dc.date.available
2013-06-13T08:52:32.421Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/5696
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-9895
dc.description.abstract
In der vorliegenden Arbeit werden neue analytische Methoden für den Nachweis
von tierischen Proteinen in Nebenprodukten und Futtermitteln beschrieben.
Aufgrund der Durchsetzbarkeit von Rechtsvorschriften zur Bekämpfung der
transmissiblen spongiformen Enzephalopathie (TSE) der Europäischen Union und
hinsichtlich geplanter Lockerungen dieser bedarf es dringend der Entwicklung
speziesspezifischer Nachweismethoden, um insbesondere den Eintrag bovinen
Materials in die Futtermittelkette zu verhindern. Ziel der vorliegenden Arbeit
war die Entwicklung und Validierung immunologischer Methoden zum
speziesspezifischen Nachweis prozessierter tierischer Proteine in
Futtermitteln als Alternativmethoden zur Mikroskopie. Dafür wurden zunächst
verschiedene mögliche Gewebemarker tierischen Ursprungs identifiziert und auf
ihre potentielle Eignung anhand von Sequenzvergleichen und Literaturrecherchen
überprüft. Aufgrund der extremen Stabilität und Hitzeresistenz, der
artspezifischen Sequenzunterschiede und des reichlichen Vorhandenseins in
Fleisch- und Knochenmehlen hat sich dabei das Knochenprotein Osteocalcin als
besonders geeignet erwiesen und wurde daher als Zielprotein für die zu
entwickelnden Nachweissysteme ausgewählt. Ein Schwerpunkt der vorliegenden
Arbeit lag in der Entwicklung und Optimierung eines Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay (ELISA), welcher die Detektion bovinen Materials ermöglichen
sollte. Um dabei die Assay-Spezifität auf Rinder zu beschränken, wurden sowohl
spezies- als auch sequenzspezifische polyklonale Antikörper gegen bovines
Osteocalcin generiert und auf ihre Eignung getestet. In Verbindung mit einem
kommerziellen gegen Osteocalcin gerichteten monoklonalen Antikörper konnte
daraufhin ein Sandwich-ELISA für den Nachweis bovinen Osteocalcins entwickelt
werden. Auf die Methodik des ausgearbeiteten ELISA aufbauend sollte hiernach
eine real-time-immuno-PCR (RT-iPCR) als weitere Strategie für den
sequenzspezifischen Osteocalcin-nachweis entwickelt werden. Dabei sollte
verifiziert werden, ob eine höhere Sensitivität der Detektion bovinen
Osteocalcins im Vergleich zu dem entwickelten Sandwich-ELISA erreicht werden
könnte. Abschließend wurde untersucht, inwiefern ein immunologisches
Detektionssystem für bovines Osteocalcin mittels Phage-Display-Methoden
generierbar ist. Dafür wurde, ausgehend von einer Sequenzanalyse, eine
spezifische Aminosäuresequenz bovinen Osteocalcins für die Isolierung
spezifisch bindender Phagen gewählt. Isolierte Phagen mit positiver
Bindungsaffinität gegen bovines Osteocalcin konnten dann in einem ELISA zum
Nachweis bovinen Osteocalcins eingesetzt und anhand einer DNA-Sequenzierung
das interagierende Peptid charakterisiert werden. Nach der Optimierung
einzelner Arbeitsschritte wurde die Leistungsfähigkeit für die genannten
Systeme untersucht. Dabei wurden die Möglichkeiten und Grenzen der
entwickelten Nachweismethoden anhand von Referenzmaterialien und
handelsüblichen Proben aufgedeckt. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der
entwickelte ELISA, als auch die RT-iPCR den Nachweis bovinen Osteocalcins mit
einer Sensitivität von 1 ng Osteocalcin bei ausgeprägter Spezifität
ermöglichen. Für beide Systeme konnte außerdem eine bemerkenswerte
Nachweisgrenze von 0,1 % bovinen Fleisch- und Knochenmehls in pflanzlichen
Futtermitteln ermittelt werden. Dabei wurde ein bovines Fleisch- und
Knochenmehl genutzt, welches sogar bei 145 °C behandelt wurde, was über den
gesetzlich festgelegten Forderungen liegt. Darüber hinaus konnte gezeigt
werden, dass durch den Einsatz einzelner in vitro selektierter Phagenklone in
einem direkten ELISA sowohl reines bovines Osteocalcin, als auch ein hoch
prozessiertes bovines Fleisch- und Knochenmehl detektiert werden konnte. Die
Ergebnisse belegen die Möglichkeit des speziesspezifischen, selektiven
Nachweises von tierischen Proteinen in Futtermitteln, basierend auf bekannten
Osteocalcinsequenzen. Der hier beschriebene Osteocalcin-Assay könnte die
Grundlage für ein validiertes Nachweisverfahren als Werkzeug für die
Sicherstellung und Überprüfung der Einhaltung des Verfütterungsverbots werden
und somit zu einer Verbesserung der Bekämpfung der Transmissiblen spongiformen
Enzephalopathien führen. Ein weitreichender Einsatz der entwickelten ELISA-
Methode für den speziesspezifischen Nachweis tierischer Proteine in
Futtermitteln anderer Spezies ist denkbar.
de
dc.description.abstract
In this work, new analytical methods for the detection of animal proteins in
animal feed and by-products are described. Due to the enforcement of
legislation against transmissible spongiform encephalopathy (TSE) of the
European Union and of the planned relaxation of this, it needs urgent
development of species-specific detection methods, in particular to prevent
the entry of bovine material in the feed chain. The aim of this study was the
development and validation of immunological methods for species-specific
detection of processed animal proteins in feed as alternative methods of
microscopy. Therefore, first a number of possible tissue markers of animal
origin have been identified and tested for their potential suitability on the
basis of sequence comparisons and literature searches. Due to the extreme
stability and heat resistance, the species-specific differences in sequence
and the abundant presence in meat and bone meal the bone protein osteocalcin
has proved to be particularly suitable and was therefore selected as the
target protein for the detection systems to be developed. One focus of this
work was the development and optimization of an enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA), which should enable the detection of bovine material. To limit
the assay specificity on cattle, both species- and sequence-specific
polyclonal antibodies have been generated against bovine osteocalcin and
tested for their suitability. In combination with a commercial monoclonal
antibody directed against osteocalcin a sandwich ELISA for the detection of
bovine osteocalcin has been developed. Based on the methodology of the
elaborated ELISA, a real-time immuno-PCR (RT-iPCR) should be developed as
another strategy for sequence-specific detection of osteocalcin. It should be
verified whether a higher sensitivity of the osteocalcin-detection compared to
the developed sandwich ELISA might be achieved. Finally, it was investigated
whether an immunological detection system for bovine osteocalcin is
developable using phage display methodology. Therefore, based on a sequence
analysis, a specific amino acid sequence of bovine osteocalcin was chosen for
the isolation of specifically binding phage. Isolated phage with positive
binding affinity against bovine osteocalcin were used in an ELISA for the
detection of bovine osteocalcin and the interacting peptide was characterizes
by the use of DNA sequencing. After optimization of individual work steps, the
efficiency for those systems was verified. The possibilities and limitations
of the developed detection methods based on reference materials and commercial
samples were investigated. It could be demonstrated, that both the developed
ELISA, as well as the RT-iPCR enable the detection of bovine osteocalcin with
a sensitivity of 1 ng osteocalcin with distinctive specificity. For both
systems a remarkable detection limit of 0.1 % bovine meat and bone meal could
be determined in plant feed. Therefore a bovine meat and bone meal was used,
which was even treated at 145 °C, which is above the statutory requirements.
Moreover, it was demonstrated that due to the use of individual in vitro
selected phage clones in a direct ELISA both pure bovine osteocalcin, as well
as a high processed bovine meat and bone meal could be detected. The results
demonstrate the possibility of species-specific, selective detection of animal
proteins in animal feed, based on known osteocalcin sequences. The described
osteocalcin assay could be the basis for a validated detection method for
ensuring the compliance of the feed ban and therefore lead to an improvement
in the fight against transmissible spongiform encephalopathy. A far-reaching
application of the developed ELISA method for the species-specific detection
of animal proteins in feed for other species is possible.
en
dc.format.extent
XI, 129 S.
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
meat and bone meal
dc.subject
bovine spongiform encephalopathy
dc.subject
animal feeding
dc.subject
species diversity
dc.subject.ddc
600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften::630 Landwirtschaft::630 Landwirtschaft und verwandte Bereiche
dc.title
Identifizierung und Nachweis von tier- und gewebespezifischen Markern in
tierischen Nebenprodukten und Futtermitteln zur Eindämmung der Übertragung der
transmissiblen spongiformen Enzephalopathie (TSE)
dc.contributor.firstReferee
Univ.-Prof. Dr. Jürgen Zentek
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Dr. Alfonso Lampen
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Wolf-Rüdiger Stenzel
dc.date.accepted
2013-04-30
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-fudissthesis000000094358-1
dc.title.translated
Identification and detection of animal- and tissue-specific marker in animal
by-products and animal feed to reduce the transmission of transmissible
spongiform encephalopathy (TSE)
en
refubium.affiliation
Veterinärmedizin
de
refubium.mycore.fudocsId
FUDISS_thesis_000000094358
refubium.note.author
Mensch und Buch Verlag
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FUDISS_derivate_000000013482
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free
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open access