Engineering high specificity peptide inhibitors of a promiscuous protein- protein interaction domain with implications in cystic fibrosis

Abstract

Cystic Fibrosis (CF) is one of the most common lethal hereditary diseases among caucasians and affects multiple organs in humans, resulting in an average life expectancy of about 37 years. The most abundant mutation leading to the symptoms of CF is the single deletion of a Phe in the sequence of an ion channel involved in CF (delta-F508-Cystic Fibrosis Conductance Regulator or delta-F508-CFTR) resulting in a reduced ability of epithelial cells to transport Cl--ions across the plasma membrane. This causes an osmotic imbalance, causing the airway surface mucus in the lung to thicken, which in turn prevents airway cilia from executing effective mucus clearance which leads to the symptoms of CF. Emerging chronic infections with bacteria like Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa further reduce lung functionality, and are the main reasons for patient mortality. Therefore, a key therapeutic goal to reduced CF-patient morbidity and mortality is the restoration of sufficient mutant CFTR activity to ameliorate chronic lung infections. Different classes of therapeutic agents are being developed to address the folding defect ('correctors') and the gating defect ('potentiators') of delta-F508-CFTR, but 'stabilizers' that specifically address the half-life deficiency have not yet been identified. The PDZ containing proteins CAL (CFTR-Associated Ligand) and its antagonists NHERF1 and NHERF2 (Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1/2) compete for CFTR binding. CAL contains one (CALP), and each NHERF protein contains two PDZ domains (N1P1, N1P2, N2P1 and N2P2) that control both the activity and the cell surface abundance of CFTR. NHERF proteins increase CFTR activity at the apical membrane, whereas CAL promotes its lysosomal degradation. Thus, to explore novel therapeutic strategies for increasing the cell-surface abundance of CFTR, the goal was to design a selective inhibitor of the CFTR:CAL interaction that does not affect the biologically relevant PDZ competitors NHERF1 and NHERF2. This work represents the development and execution of a unique SPOT- synthesis approach to engineer selective peptide based inhibitors for CALP, thus increasing Cl--efflux across the plasmamembrane of human lung epithelial cells stably expressing delta-F508-CFTR (CFBE-delta-F cells). This approach allowed us to: (I) identify the natural highest affinity ligand of CAL (SSR5; Ki = 21.4 ± 1.7 µM) among 6223 C-terminal peptides, (II) further enhance its CALP affinity beyond the SSR5 binding affinity, and (III) totally abolish NHERF binding. The resulting decamer peptide, ANSRWPTSII (iCAL36; Ki = 17.3 ± 4.3 µM), was validated by NMR studies to act as a competitive inhibitor of the CFTR:CALP interaction, and its biological functionality was ascertained by determination of Cl--efflux across the plasmamembrane of polarized CFBE- delta-F cell monolayers. Thus, iCAL36 is able to enhance Cl--efflux by 25 % at 500 µM, and is exhibits additive effects with the small molecule delta-F508-CFTR corrector Corr-4a. This finding was demonstrated by combinatorial treatments in Ussing chambers. However, mass spectrometry and pull down analysis revealed a single off-target effect with the PDZ domain of the Tax-interacting protein-1 (Tip-1 ). To address this undesired peptide binder, we again utilized our peptide engineering approach combined with X-ray analysis. The result was another CALP inhibitor, named iCAL42 (ANSRLPTSII; Ki = 10.8 ± 0.2 µM) with single PDZ-specificity and with a positive effect on Cl --efflux.. iCAL42 was created by a single Trp-Leu substitution, and specificity was demonstrated by LC/MS/MS analysis combined with pull-down assays. For both peptides, cell internalization was initially achieved using the commercially available delivery reagent BioPORTER™ and demonstrated by fluorescence microscopy. However, to test if the internalization rate of our engineered peptide is sufficient for a therapeutic application, we coupled iCAL36 covalently to cell penetrating peptides (CPPs) and tested for: (I) uptake (confocal microscopy), (II) cytotoxicity (CCK-8 assay), and (III) biological functionality (Ussing chamber). We were able to clearly demonstrate that the chosen CPPs (Penetratin and MPG) were able to internalize iCAL36 into CFBE cells without relevant cytotoxicity, up to a concentration of 100 µM. Ussing chamber experiments revealed a Cl--efflux of 21 % (p = 0.2) at a 5 fold lower concentration (100 µM) of Penetratin-iCAL36 compared to F* iCAL36 (500 µM):BioPORTER™. This demonstrates the improved effectiveness of therapeutic peptide delivery by this CPP. These results show that our engineering process of CALP inhibitors may provide a template that is useful for investigating the cell-biological roles and therapeutic potential of other PDZ domains. Furthermore, the engineered CALP inhibitors potentially give the new opportunity to analyze the effects of CAL inhibition on CFTR expression in primary CF patient-derived bronchial epithelial cells. Additionally, the may help to explore the prospect of combination approaches aimed at parallel treatment of the biogenesis and stability defects of the most common disease associated CFTR allele delta-F508 with the potential to attenuate the symptoms of patients with cystic fibrosis in future therapeutic applications.

Mukoviszidose (Cystische Fibrose - CF) ist eine der häufigsten, tödlichen Erbkrankheiten unter Kaukasiern mit einer durchschnittlichen Lebenserwartung von ca. 37 Jahren.. CF wird meist durch die Deletion eines Phenylalanins innerhalb eines Chloridkanales (delta-F508-Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator; delta-F508-CFTR) hervorgerufen, was zu einer verminderten Chloridionen-Ausscheidung an der Zellmembran von Epithelzellen führt. Die daraus resultierende Verdickung des durch die Epithelzellen gebildeten Schleims (Mukus), erschwert oder verhindert dessen Abtransport durch die Zilien der Zellen. Die hierdurch entstehenden Infektionen mit Bakterien wie Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa verringern die schon beeinträchtigte Lungenfunktionalität noch zunehmend, was die hohe Mortalität von CF-Patienten bedingt. Ein Schwerpunkt heutiger CF-Therapien liegt in der Wiederherstellung der CFTR-Aktivität, um u. A. die chronischen Lungeninfektionen zu verhindern. Diesbezüglich wurden bereits verschiedene Therapeutika entwickelt, die entweder die Fehlfaltung des delta-F508-CFTR verhindern (Korrektoren) oder dessen verminderter Aktivität entgegenwirken (Potenzierer) sollen. Spezifische "Stabilisatoren", welche die CFTR- Halbwertszeit an der Zellmembran und somit deren Aktivität erhöhen können, wurden bisher noch nicht entwickelt. Im Kontext eben dieser "Stabilisatoren" spielen vor allem die PDZ Proteine CAL (CFTR-Associated Ligand) und seine Antagonisten NHERF1 und NHERF2 (Na+/H+ Exchanger Regulatory Factor 1/2) ein große Rolle. Sie konkurrieren um die Bindung an den CFTR und kontrollieren sowohl den CFTR-Transport an die Zelloberfläche als auch dessen Aktivität. CAL enthält eine (CALP) und jede der NHERF Proteine zwei PDZ-Domänen (N1P1, N1P2, N2P1 und N2P2), wobei die NHERF Proteine die CFTR-Aktivität und Menge an der apikalen Membran erhöhen, während CAL dessen lysosomalen Abbau fördert. So würde die Entwicklung spezifischer CFTR:CAL Inhibitoren, die keine weiteren Interaktionen zu anderen PDZ Proteinen aufweisen, die CFTR-Menge an der Plasmamembran erhöhen bzw. stabilisieren. Die hier vorgestellte Arbeit beschreibt die Entwicklung einer neuen Strategie für die Entwicklung von selektiven, peptid-basierten CALP-Inhibitoren. Diese sollen den Cl- Ausstoß an der Plasmamembran von humanen Lungenepithelzellen, die den delta-F508-CFTR exprimieren (CFBE-delta-F Zellen), erhöhen. Dieser auf der SPOT-Synthese basierte Ansatz erlaubte es uns: (I) den besten natürlichen CALP-Binder unter 6223 humanen C-terminalen Peptiden zu identifizieren (SSR5; Ki = 21.4 ± 1.7 µM), (II) dessen Affinität weiter zu erhöhen und (III) dabei die Bindung zu den NHERF-Proteinen komplett zu unterbinden. Das hierbei entwickelte dekamere Peptid iCAL36 (ANSRWPTSII; Ki CALP = 17.3 ± 4.3 µM) agiert nachweislich als kompetitiver Inhibitor der CFTR:CALP Interaktion, was durch NMR-Analysen nachgewiesen werden konnte. In CFBE-delta-F Zellen führt iCAL36 (500 µM) zu einer Erhöhung des Cl--Ausstoßes um 25 % (Ussing Kammer, p = 0.0008). Eine gleichzeitig Anwendung von iCAL36 mit dem CFTR-Korrektor Corr-4a führt zudem zu einer entsprechenden weiteren Erhöhung des Cl--Ausstoßes an der Zellmembran, was die Kombinierbarkeit von iCAL36 mit Korrektoren demonstriert. Jedoch zeigten MS/MS Analysen sowie pull-down Bestimmungen, dass iCAL36 noch eine weitere PDZ-Interaktion mit dem Tax-interacting protein-1 (TIP-1) eingeht. Mit Hilfe unserer Strategie kombiniert mit Röntgenstrukturanalysen konnte allerdings ein zweiter CALP Inhibitor (iCAL42; ANSRLPTSII; Ki CALP = 10.8 ± 0.2 µM) mit absoluter CALP-Spezifität entwickelt werden, der einen zu iCAL36 vergleichbaren positiven Effekt auf den Cl--Ausstoßes aufweist. Die zelluläre Peptidaufnahme (500 µM) wurde hierbei zunächst durch das kommerziell erhältliche Reagenz BioPORTER™ realisiert. Um die Zell-Internalisation weiter zu effektivieren, wurde unser iCAL36-Inhibitor jedoch im weiteren Verlauf kovalent an zellpenetrierende Peptide (CPPs) gekoppelt und bezüglich (I) ihrer Aufnahme (konfokale Mikroskopie), (II) ihrer Zytotoxizität (Viabilitätsbestimmung) sowie (III) ihrer biologischen Funktionalität (Ussing Kammer) in CFBE-F Zellen untersucht. Hierbei konnte eindeutig festgestellt werden, das iCAL36 gekoppelt an Penetratin bis zu einer Konzentration von 100 µM ohne auftretende Zytotoxizität aufgenommen werden kann. Zudem beweist der an der Zellmembran gemessene Cl--Ausstoß von 21 % (p = 0,02) bei einer 5-fach niedrigeren Konzentration im Vergleich zum BioPORTER™:F*-iCAL (500 µM) System die verbesserte Effektivität der Internalisierung. Zusammenfassend, stellt unser peptid-basierter Entwicklungsprozess eine gute Grundlage für die zellbiologische Untersuchung von PDZ Domänen im therapeutischen Kontext dar. So ermöglicht die Entwicklung von CALP-Inhibitoren (iCAL36 oder iCAL42) im Bezug auf Mukoviszidose die CFTR Expression in primären bronchialen Epithelzellen von CF-Patienten zu analysieren . Auch ein kombinatorische Ansatz zur parallelen Behandlung der Biogenese- und Stabilitätsdefekte des häufigsten krankheitsassoziierten delta-F508-CFTR Mutation kann hierdurch besser untersucht werden, um in Zukunft die Symptome von CF-Patienten schneller und besser lindern zu können.