Im Mittelpunkt der von mir durchgeführten Arbeiten der letzten 10 Jahre stehen die Krankheitsmechanismen in der Entstehung der humanen ANCA-assoziierten Vaskulitis und Glomerulonephritis. Ich führte dabei Untersuchungen im in vitro Zellaktivierungsmodell und im in vivo Tiermodell durch. Die Quintessenz der vorliegenden Untersuchungen ist, dass die ANCA-induzierte Glomerulonephritis durch die Interaktion zwischen den ANCA IgG und den neutrophil-exprimierten ANCA-Antigenen PR3 und Myeloperoxidase vermittelt wird. Hierbei wird eine inflammatorische Kaskade initiiert, welche mit der Membranexpression der PR3 auf den neutrophilen Granulozyten beginnt und über die Bindung der ANCA an diese, die nachfolgende Aktivierung verschiedener Signaltransduktionswege, wie des PI3K/Akt Weges bewirkt, die zur konsekutiven neutrophilen-vermittelten Gewebsschädigung und Vaskulitis führt. Wir beschreiben in dieser Kaskade einerseits die Mechanismen der Antigenexpression auf den neutrophilen Granulozyten und versuchen andererseits, die genauen Wege der Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch ANCA tierexperimentell und in der Zellkultur zur überprüfen. Durch diverse in vitro Experimente konnten wir an humanen Zellen die Interaktion zwischen den Autoantikörpern und den neutrophil- exprimierten Antigenen genau charakterisieren. Diese Untersuchungen geben einen wichtigen Einblick in die Pathogenese dieser Erkrankung. Die Verwendung von tierexperimentellen Modellen der ANCA-induzierten Vaskulitis ermöglichte es uns zusätzlich, die Funktion spezifischer Proteine, Rezeptoren und Signaltransduktionswege in einem komplexen Tiermodell zu überprüfen. Hierbei wurden zahlreiche Methoden angewendet, wie die Nutzung von konventionellen Keimbahndeletionen, Kochenmarktransplantationen, Aufreinigung von Proteinen, immunhisto- und immunzytochemische Analysen, quantitativer RT-PCR, Western- Blot-Analysen, FACS-Analysen (neben diversen anderen Standardmethoden). Im ersten Teil der Arbeiten lag der Schwerpunkt auf der detaillierten Charakterisierung und dem Verständnis der Membranexpression des ANCA-Antigens Proteinase 3 (PR3) auf neutrophilen Granulozyten. Wir zeigten hier, dass die sehr heterogene Membranexpression der PR3 einer genetischen Kontrolle unterliegt. Wir fanden eine signifikante Assoziation zwischen PR3-Membranexpression und der klinischen Manifestation der ANCA-Erkrankung. Darüber hinaus konnten wir erstmalig zeigen, dass die Membranexpression der PR3 unabhängig vom intrazellulären (Gesamtzell-) Gehalt an PR3 ist und somit durch eine unterschiedliche Membranpräsentation zu erklären ist. Dieses wurde dann später durch die Identifizierung eines PR3-Membranrezeptors bestätigt. In einer Folgearbeit konnten wir demonstrieren, dass die Membranexpression der PR3 die Stimulierbarkeit der neutrophilen Granulozyten durch PR3-ANCA bestimmt, indem wir eine stärkere Aktivierung von Signaltransduktionswegen und eine vermehrte Generierung reaktiver Sauerstoffradikale demonstrierten. Dieses konnte zum ersten Mal erklären, wie die Membranexpression der PR3 den klinischen Verlauf der Erkrankung beeinflussen könnte. Der nächste Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Identifizierung der primären Ziel- und Effektorzelle in der ANCA-assoziierten Vaskulitis im komplexen Tiermodell. Hierin konnten wir durch verschiedene Methoden darstellen, dass zirkulierende, myeloide, von dem Knochenmark gebildete Zellen das primäre Zell der ANCA darstellen und notwendig wie ausreichend zur Induktion der ANCA- Glomerulonephritis sind. Zudem war es uns möglich, ein neues und robusteres Tiermodell der anti-MPO induzierten Vaskulitis zu entwickeln, mit dem es uns im Weiteren möglich ist, die Erkrankung besser zu untersuchen. Wir verwendeten dieses optimierte Tiermodell für Untersuchungen zur Rolle des Komplementsystems in der Pathogenese der ANCA-assoziierten Vaskulitis und konnten hier insbesondere den Anaphylatoxinrezeptor für C5a als entscheidend herausarbeiten. Es war uns hierbei möglich, einen neuen Amplifizierungskreis der Aktivierung der neutrophilen Granulozyten durch ANCA zu identifizieren, welches durch die Generierung von C5a vermittelt wird. Der letzte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit den detaillierten Signaltransduktionswegen in der Aktivierung neutrophiler Granulozyte durch ANCA und hierbei mit dem Schlüsselweg der PI3Kγ. Wir konnten in dieser Arbeit diesen Signaltransduktionsweg als essentiell für die ANCA-induzierte Vaskulitis identifizieren. Die Erkenntnis, dass die spezifische pharmakologische Inhibition dieser Kinase zu einer deutlich reduzierten Erkrankungsschwere im Tiermodell der ANCA-induzierten Vaskulitis führte, könnte zur Entwicklung eines alternativen Therapiekonzeptes in der Behandlung der ANCA-assoziierten Vaskulitis führen.
In the last 10 years of our research I have focused on the underlying mechanisms that are involved in the pathogenesis of ANCA-induced vasculitis and glomerulonephritis. We have performed studies using in vitro cell culture methods and in vivo animal models. In summary we could demonstrate that the interaction between ANCA IgG and the ANCA antigen-expressing neutrophil granulocytes is responsible for inducing an vasculitis. Through the interaction between ANCA IgG and neutrophils an inflammatory cascade is initiated, which triggers the membrane expression of ANCA antigens, permitting the binding of the IgG to the neutrophil membrane. This in turn triggers different signal transduction pathways finally leading to the full activation of neutrophils resulting in the observed tissue injury and vasculitis. We have described the mechanisms of ANCA antigen expression and have focused on the activation pathways in cell culture experiments and in vivo animal models. In the first part of our work we have characterized the mechanisms of the ANCA antigen proteinase 3 expression on the membrane of neutrophil granulocytes. We could demonstrate that this expression is genetically controlled. In a different work we could show that the membrane expression of proteinase 3 controls the activation of neutrophil granulocytes by PR3-ANCA. Finally we could show that the proteinase 3 expression correlates with the clinical manifestation of ANCA vasculitis. In the next set of experiments we have identified circulating bone-marrow derived cells as primary target of ANCA IgG by in vivo animal experiments. Using this animal model we have demonstrated in a later work that the complement system and the anaphylatoxin C5a and the receptor C5aR play a fundamental role in ANCA vasculitis. In the last set of our work we have focused on the identification of signaling pathways essentially involved in ANCA vasculitis. Here we have identified PI3Kγ as a central signaling pathway by in vitro and in vivo experiments. This could potentially lead to alternative treatment approaches of ANCA vasculitis.
