Untersuchungen möglicher genetischer Ursachen von renalen Endorganschäden bei hypertensiven Munich Wistar Frömter-Ratten

Abstract

Die Munich Wistar Frömter (MWF)-Ratte stellt ein geeignetes Tiermodell dar, um die Entwicklung von Bluthochdruck und dessen Folgeschäden zu untersuchen, da MWF-Tiere eine milde spontane Hypertonie zusammen mit einer progressiven Albuminurie ausbilden. Weiterhin weisen MWF-Ratten einen sexuellen Dimorphismus bezüglich des Nierenschadens auf: MWF-Männchen bilden eine stärkere Albuminurie mit Glomerulosklerose aus als Weibchen. In Vorarbeiten wurde ein Verlust der podozytären Podoplanin-Expression als frühe pathophysiologische Veränderung nachgewiesen. Zusätzlich haben MWF-Ratten eine deutlich reduzierte Nephronzahl, die in der 4. Woche gegenüber Albuminurie- resistenten spontan hypertensiven Ratten (SHR) um 27 % erniedrigt und bereits im Embryonalstadium nachweisbar ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst mittels fetaler Genexpressionsanalysen (Microarray-Technologie) Kandidatengene für das angeborene Nephrondefizit bei MWF identifiziert. Die Expression der Kandidatengene wurde anschließend im Zeitverlauf am frühembryonalen Entwicklungstag (E)15,5, im spätfetalen Stadium E19,0 und im Alter von 4 Wochen nach Abschluss der Nephrogenese per Reverse Transcription-qPCR quantifiziert. Als Referenzstamm dienten SHR nach sogenanntem Stage-Matching an E16,0 bzw. E19,5. Weiterhin wurde der Einfluss von Testosteron auf die Albuminurieentwicklung bei männlichen MWF-Ratten analysiert. Hierfür wurde die renale Albuminausscheidung adulter Tiere nach Orchiektomie (Ox), nach Ox mit Testosteron-Substitution und zusätzlicher Androgenrezeptorblockade mit Flutamid (OxTF) im Vergleich zu scheinbehandelten Tieren (Sham) untersucht. Die Transkriptom-Analyse von MWF und SHR ergab 311 signifikant differentiell exprimierte Transkripte, von denen sieben auf Rattenchromosom 6 lokalisiert waren, dessen Einfluss auf die Ausbildung von Albuminurie und Nephronzahl beim MWF-Stamm in Vorarbeiten nachgewiesen wurde. Vier Gene waren bei MWF signifikant hochreguliert (Abcg5, Ab1-233, Efcab11, Gpx2) und drei Gene waren signifikant niedriger exprimiert (Fntb, Lrrn3, Rtn1). Besonders interessant war das Gen Glutathionperoxidase 2 (Gpx2), dessen Expression in murinen embryonalen Nieren bereits beschrieben wurde. Gpx2 war in allen drei Altersstadien bei MWF gegenüber SHR signifikant hochreguliert. Die Testosteron-Studie ergab für MWF Sham den erwarteten progressiven Verlauf der Albuminurie, die in der 18. Woche Werte von 48,30 ± 6,16 mg/24h erreichte. Nach Kastration verminderte sich die Albuminurie gegenüber Sham um mehr als die Hälfte. In der OxTF-Gruppe wurde trotz erhöhter Testosteron-Serumspiegel nach Testosteron-Substitution die Albuminurie durch Flutamid unterdrückt und lag mit Werten von 6,40 ± 1,19 mg/24h signifikant unter dem Niveau der unbehandelten Ox-Gruppe. Weiterhin konnte in vitro in einer humanen Podozyten- Zelllinie ein direkter Zusammenhang zwischen einer Stimulation mit Angiotensin II und einer verminderten Podoplanin-Expression nachgewiesen werden. Mittels der vorliegenden Untersuchungen konnten interessante Kandidaten sowohl auf molekularer als auch auf hormoneller Ebene identifiziert werden, die in die Pathogenese des Nierenschadens beim MWF-Stamm involviert sein könnten. Weitere Untersuchungen müssen jedoch genauer die zugrundeliegenden Mechanismen klären.

Munich Wistar Frömter (MWF) rats represent a valuable animal model to investigate the development of hypertension and its cardiovascular and renal organ damage, as MWF animals develop mild hypertension and progressive albuminuria. Besides, MWF rats exhibit a sexual dimorphism in kidney damage with a more pronounced degree of albuminuria and glomerulosclerosis in males. A loss of podoplanin expression in podocytes is one possible pathophysiologic mechanism. Furthermore, the MWF strain develops an inborn nephron deficit, which can already be detected at embryonic day (E)15.5. In this study microarray gene expression analysis of embryonic rat kidneys was performed to identify candidate genes for the impaired nephron induction in MWF. Specific candidates were further analyzed by reverse transcription-qPCR at E15.5 as early-stage kidney, E19.0 as late-stage fetal kidney, and in week 4 when nephrogenesis is completed. Spontaneously hypertensive rats (SHR) were used as reference strain after stage-matching at E16.0 and E19.5, respectively. Furthermore, the effect of testosterone on the development of albuminuria was investigated in male MWF rats. Adult animals were either orchiectomized (Ox), or orchiectomized and treated with both, testosterone and the androgen receptor antagonist flutamide (OxTF), and compared to sham-operated rats (Sham) by measuring the renal albumin excretion. Transcriptome analysis revealed 311 transcripts with significant expression differences between MWF and SHR. Seven genes were located on rat chromosome 6 that was previously linked to the development of albuminuria and nephron deficit in the MWF strain. Four genes were significantly upregulated in MWF (Abcg5, Ab1-233, Efcab11, Gpx2), and three genes were significantly downregulated (Fntb, Lrrn3, Rtn1). Gpx2, encoding the glutathione peroxidase 2, seemed of special interest, as its expression in murine embryonic kidney was already reported. The testosterone study displayed a progressive development of albuminuria in MWF Sham animals with an albumin excretion of 48.30 ± 6.16 mg/24h in 18 week old rats. After orchiectomy, albuminuria was reduced by more than 50 % compared with MWF Sham. In OxTF animals testosterone levels were higher after testosterone substitution than in the Sham group. However, androgen receptor blockade with flutamide further suppressed albuminuria to levels of 6.40 ± 1.19 mg/24h. Furthermore, a molecular link between angiotensin II stimulation and reduced podoplanin expression was identified in cultured human podocytes. The current study revealed interesting candidates – molecular and hormonal – that could be involved in the pathogenesis of renal damage in the MWF strain. Further investigations are needed to clarify their specific functions and mechanisms.