Synthesis and Biological Evaluation of Artificial Metalloproteases Based on Amphiphilic Cyclen Derivatives

Abstract

Numerous diseases are caused by the misfolding of specific proteins and the subsequent formation of aggregates, for example Parkinson's disease, type II diabetes and Alzheimer's disease (AD). In the last years the scientific interest in AD has grown remarkably due to new insights into the development of this complex disorder. Numerous therapeutic strategies have been developed for the treatment of AD. Cleavage of pathogenic misfolded proteins and their aggregates with small metal complexes acting as artificial proteases is one of them. Cu(II) and Co(III) complexes of the macrocycle cyclen were shown to cleave proteins and numerous derivatives have already been synthesized to improve the proteolytic activity. In the scope of the present thesis monoalkylated derivatives of cyclen and its oxa and dioxa analoga were synthesized. Amphiphilic metal complexes of these ligands were generated to investigate the influence of micelle formation on the proteolytic activity of cyclen. Five ligands and their Cu(II) complexes as well as two Co(III) complexes were synthesized. The protein cleavage ability was investigated via SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) with various model proteins. An increase of at least two orders of magnitude was observed with all seven complexes compared to the corresponding cyclen compounds. A comparison of the cyclen complexes of varying alkyl chain length could show that the proteolytic activity depends on the number of CH2 groups in the chain with the longest alkyl moiety being the most effective cleavage agent. The highest activity of all complexes could be detected with the Co(III) complex of 1-hexadecylcyclen, even though an improvement of the activity was expected for the oxa analoga of the same chain length. Remarkably, the ligands alone exhibited a comparable proteolytic activity to the complexes. Further investigations are necessary to exclude traces of metal as origin for this activity. An interesting finding was the decrease of the proteolytic activity above a certain complex concentration towards heme proteins, whereas non-heme protein cleavage increases consistently with the complex concentration. Molecular modeling studies are underway to further investigate these results. Fragments of the cleavage process were detected by MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) mass spectrometry. One of the fragments found in these studies reflects a specific cleavage site in proximity to the heme group of myoglobin already established in the literature as initial cleavage site of another cyclen derivative. These findings suggest a key role for the heme group in the cleavage process of heme proteins. Cytotoxicity studies via MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay showed a drastic increase of the cytotoxicity for the complexes of 1-dodecylcyclen compared to cyclen. However, in comparison with other compounds currently under investigation for the treatment of AD the cytotoxicity is moderate. The critical micellar concentration of the complexes was observed with the "pyrene 1:3 ratio" method, a technique based on fluorescence, and the values range from 0.04 - 0.47 mM. No distinct relation could be found for the formation of micelles and the cleavage activity. The results presented in this work, in particular the outstanding proteolytic activity of the complexes, suggest further studies with amphiphilic cyclen derivatives. The alkylated complexes have a rather simple structure compared to other artificial proteases but exhibit a comparable cleavage activity towards all model proteins. Targeted cleavage of pathogenic proteins might be achieved by introduction of recognition sites to the amphiphile.

Zahlreiche Krankheiten, wie z.B die Parkinson-Krankheit, die Alzheimer- Krankheit und Diabetes mellitus Typ II, werden durch die Fehlfaltung spezifischer Proteine und der daraus resultierenden Bildung von Aggregaten ausgelöst. Besonders die Alzheimer-Krankheit hat in den letzten Jahren ein ansteigendes wissenschaftliches Interesse erfahren, ausgelöst durch neue Einblicke in die Entstehung dieser komplexen Erkrankung. Für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit wurden verschiedene Strategien entwickelt. Die Spaltung der pathogenen, fehlgefalteten Proteine und ihrer Aggregate mit Metallkomplexen als künstliche Proteasen ist eine dieser Strategien. Für die Cu(II)- und Co(III)-Komplexe des Cyclens konnte proteolytische Aktivität nachgewiesen werden. Zahlreiche Derivate wurden seitdem basierend auf dem Cyclen-Grundgerüst untersucht, um diese Aktivität zu steigern. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden monoalkylierte Derivate des Cyclens und entsprechende Oxa- und Dioxa-Analoga dargestellt. Mit Komplexen dieser amphiphilen Verbindungen wurde der Einfluss von Mizellenbildung auf die Spaltaktivität gegenüber verschiedenen Modell-Proteinen untersucht. Fünf amphiphile Liganden und deren Cu(II) Komplexe konnten synthetisiert werden. Zwei Co(III) Komplexe basierend auf den dargestellten Liganden konnten ebenfalls synthetisiert werden. Die proteolytische Aktivität wurde mittels SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) mit verschiedenen Proteinen untersucht. Ein Anstieg um mindestens zwei Größenordnungen} konnte mit allen Komplexen im Vergleich zu Cu(II)-Cyclen nachgewiesen werden. Ein Vergleich von Cyclen-Derivaten mit unterschiedlicher Kettenlänge zeigte die Abhängigkeit der Aktivität von der Anzahl der CH2-Gruppen in der Alkylkette, wobei das Derivat mit dem längsten Alkylrest die höchste Aktivität zeigte. Obwohl ein Anstieg der Aktivität für die Oxa- Spezies erwartet wurde, konnte die höchste Aktivität aller Komplexe für Co(III)-Hexadecylcyclen nachgewiesen werden. Bemerkenswert war die proteolytische Aktivität der Liganden, die vergleichbar war mit der Aktivität der Komplexe. Weitere Nachforschungen sind notwendig, um Metallspuren als Quelle dieser Aktivität auszuschließen. Für Hämproteine zeigte sich ein Abfall der proteolytischen Aktivität ab einer bestimmten Komplexkonzentration, wohingegen die Spaltaktivität gegenüber Proteinen ohne Hämgruppe mit der Konzentration der spaltenden Spezies steigt. Um diesen Sachverhalt zu klären, werden derzeit Molecular Modeling-Studien durchgeführt. Fragmente der Spaltung von Myoglobin konnten mittels MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) Massenspektrometrie nachgewiesen werden. Eines dieser Fragmente kann einer Spaltung nahe der Hämgruppe zugeordnet werden. Die entsprechende Spaltstelle wurde bereits in der Literatur mit einem anderen Cyclen-Derivat als erste Schnittstelle im Spaltprozess zugeordnet. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen lassen eine Schlüsselrolle für die Hämgruppe bei der Spaltung von Hämproteinen vermuten. Cytotoxizitätsstudien mittels MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium-bromid)-Assay zeigten einen deutlichen Anstieg der Toxizität der Komplexe von 1-Dodecylcyclen im Vergleich mit den entsprechenden Cyclen-Komplexen. Jedoch ist die Toxizität vergleichbar mit anderen Spezies, die derzeit als mögliche Alzheimer- Therapeutika untersucht werden. Die kritische Mizellenkonzentration der Komplexe wurde mit der Pyren 1:3-Methode untersucht, einer auf Fluoreszenz basierenden Methode. Die ermittelten Werte liegen zwischen 0.04-0.47 mM} Die hier dargestellten Ergebnisse, insbesondere die hervorragende Spaltaktivität der untersuchten Komplexe, legen weitere Studien mit amphiphilen Cyclenderivaten nahe. Die alkylierten Cyclenkomplexe weisen eine deutlich weniger komplexe Struktur auf als die meisten anderen künstlichen Proteasen, zeigen aber eine vergleichbare proteolytische Aktivität auf. Die gezielte Spaltung pathogener Proteine könnte in Zukunft durch die Einführung selektiver Gruppen ermöglicht werden.