Untersuchungen zur Integration von Nukleotidsequenzen des Retikuloendotheliose Provirus in das Genom des Hühnerpocken Virus

Abstract

Erstes Ziel der vorliegenden Arbeit waren umfangreiche molekularbiologische Untersuchungen an Hühnerpocken (FPV) DNAs aus Feldausbrüchen der letzten Jahre, um festzustellen, in welchem Umfang REV Nukleotidsequenzen in das Genom integriert vorlagen. Dazu wurde eine Multiplex PCR zum gleichzeitigen Nachweis des 4b Core Proteins des FPV, der gag , pol und env Gene des REV sowie der long terminal repeats (LTR) des Retikuloendotheliose Virus (REV) etabliert. In fast allen untersuchten Feld DNAs konnten alle vier REV spezifischen Sequenzbereiche und zusätzlich ein chimäres FPV REV PCR Produkt nachgewiesen werden, was für ein Vorliegen eines in das FPV Genom integrierten fast vollständigen REV Provirus (fvRP) spricht. Mittels Long Distance PCR wurde bei drei Feld DNAs versucht, dies zu bestätigen. Der Nachweis war mit FPV spezifischen Primern, die die Integrationsstelle des fvRP umfassen, nicht möglich, sondern nur mit REV LTR spezifischen Primern. Durch die sich an die Long Distance PCR von LTR zu LTR anschließende Restriktionsenzymanalyse wurde gezeigt, daß das Amplikon dem REV Provirus entsprach. Ferner wurden die Integrationsstelle des fvRP einer Feld DNA und des Vakzinestammes HP B sowie das FPV und REV Sequenzen umfassende chimäre PCR Produkt der Feld DNA sequenziert. So konnte auch in dem Vakzinestamm ein ca. 300 bp großer Überrest der LTR nachgewiesen werden. Der Vergleich aller drei erhaltenen Sequenzen mit entsprechenden veröffentlichten Sequenzen zeigte lediglich eine Punktmutation. Insgesamt konnte eine hohe Konserviertheit der Sequenzen bei Stämmen aus drei Kontinenten festgestellt werden. Zur Bestimmung des Verhältnisses zwischen FPV spezifischer DNA und REV provirusspezifischer DNA in einigen Feld DNAs und in verschiedenen in vitro Passagen eines Feldisolates wurde eine qPCR etabliert. Bei allen untersuchten Feld DNAs lag die Subpopulation von FPV Virionen mit integriertem fvRP in großer Überzahl vor. Die Untersuchung verschiedener in vitro Passagen zeigte einen annähernd exponentiellen Verlust des fvRP mit einer Verlustrate von ca. 0,5 (50 %) zwischen dem Originalmaterial und der 16. Passage. Nach 32 Passagen war mittels PCR keine REV spezifische DNA mehr nachweisbar. Des weiteren wurden ausführliche serologische Untersuchungen von Feldseren auf das Vorkommen von Antikörpern gegen FPV sowie REV durchgeführt. Da kein kommerzieller ELISA zum Nachweis von Antikörpern gegen FPV zur Verfügung stand, wurde ein indirekter ELISA entwickelt. Die Sensitivität betrug 85,3 %, die Spezifität 100 %. Anschließend wurde die Wiederholbarkeit der im ELISA erzielten Ergebnisse untersucht. Der Intraassay Vergleich zeigte eine gute Wiederholbarkeit. Dagegen brachte der Interassay Vergleich unbefriedigende Ergebnisse. Beim Vergleich mit anderen Methoden zum Nachweis von Antikörpern gegen FPV erwies sich der indirekte Immunfluoreszenztest als geringfügig sensitiver als der ELISA. Der AGP stellte sich als weniger sensitiv heraus. Die Untersuchung von Seren aus an FPV erkrankten Herden auf Antikörper gegen FPV und REV zeigte bei etwa der Hälfte der Tiere Antikörper gegen FPV und bei einem größeren Anteil der Tiere Antikörper gegen REV, wobei zwischen den Herden z. T. deutliche Unterschiede auftraten. Ein vergleichbarer Anteil von Seren aus gegen FPV geimpften Herden hatte Antikörper gegen FPV, aber nur in zwei der zehn untersuchten Herden hatten Tiere Antikörper gegen REV. Dies macht deutlich, daß die Bildung von REV Antikörpern von dem integrierten fvRP und nicht durch eine zufällige, gleichzeitige Infektion mit REV induziert wurden, und daß die Fähigkeit, Antikörper gegen REV zu induzieren, bei deutschen FPV Feldstämmen weit verbreitet ist. In zwei Infektionsversuchen wurde die Antikörperbildung gegen FPV und REV nach Infektion mit unterschiedlichen Zellkulturpassagen eines FPV Feldisolats und dem Vakzinestamm HP B untersucht. In beiden Versuchen induzierte das Feldisolat in einer niedrigen Passage, in der das fvRP noch mittels PCR nachweisbar war, nach intrakutaner Infektion keine Antikörper gegen FPV, aber, abhängig von der Infektionsdosis, bei einem unterschiedlich hohen Anteil der Tiere Antikörper gegen REV. Dagegen induzierte der Vakzinestamm, unabhängig von der Infektionsdosis, bei fast allen Tieren Antikörper gegen FPV, aber keine gegen REV. Das Feldisolat in einer hohen Passage, in der das fvRP mittels PCR nicht mehr nachweisbar war, induzierte bei einem geringen Anteil der Tiere Antikörper gegen FPV und keine gegen REV. Deswegen wurde vermutet, daß das integrierte fvRP zur Hemmung der Antikörperbildung gegen FPV nach einer Infektion mit einem Feldisolat beiträgt. Im ersten Versuch wurden die Tiere nach fünf Wochen intravenös mit der niedrigen Passage des Feldisolates reinfiziert. Daraufhin entwickelte etwa die Hälfte der Tiere aus den Gruppen, die zunächst auch das Feldisolat erhalten hatten, Antikörper gegen FPV. Der Anteil der Tiere mit Antikörpern gegen REV erhöhte sich geringgradig. Bei den Tieren, die zuvor vakziniert worden waren, war keine Antikörperreaktion gegen REV feststellbar. Dies kann darauf zurückzuführen sein, daß durch die vorangegangene Immunisierung mit dem Vakzinestamm eine Replikation des FPV Feldstammes und somit eine Bildung von Antikörpern gegen REV verhindert wurden. Nach der intrakutanen Infektion mit der niedrigen Passage des Feldisolates und nach der intravenösen Reinfektion ließ sich in den peripheren Blut mononukleären Zellen REV spezifische DNA, aber bis auf eine Ausnahme, keine FPV spezifische DNA nachweisen. Dies deutet auf eine Bildung infektiösen REVs aus dem FPV Feldisolat mit dem integrierten fvRP hin.

The first aim of this study was to find out by molecularbiological methods to which extent REV specific DNA was integrated into the DNA of fowlpox virus (FPV) that caused field outbreaks in Germany during the recent years. For this purpose a multiplex PCR, which detects the gene of the 4b core protein of FPV as well as gag , pol und env genes of REV and the long terminal repeats of REV, was established. In most investigated DNAs the four sequences specific for REV were detected. Additionally a chimeric FPV REV PCR product was found in most DNAs. This indicates the presence of an integrated, almost complete REV provirus (fvRP). In addition three DNAs were investigated further by long distance PCR to confirm this. The detection of the integrated fvRP was not possible with primers specific for FPV that flank the integration site of the fvRP, but only with primers specific for the LTR of REV. By adjacent restriction enzyme analysis the result was confirmed. Furthermore the integration site of the fvRP in a field DNA and in the vaccine strain HP B as well as the chimeric FPV REV PCR product from the field DNA were sequenced. By these means a remnant of the LTR of about 300 bp was detected also in the vaccine strain. Comparison of all three obtained sequences with published sequences showed only one single base pair substitution. This demonstrated a high conservation of the integration site of FPV strains from three continents. A qPCR was established to determine the ratio between DNA specific for FPV and DNA specific for REV in some field DNAs and in different passages in vitro of a field isolate. In all investigated field DNAs the FPV subpopulation with integrated fvRP predominated. When passaged in vitro, the field isolate lost the fvRP at a rate of about 0.5 (50 %) until the 16th passage. After 32 passages no DNA specific for REV was detectable by PCR. Further extensive serological investigations of field sera for antibodies against FPV and REV were carried out. As there was no commercial ELISA available for the detection of antibodies against FPV, an indirect ELISA for this purpose was established. The sensitivity was 85.3 %, the specificity 100 %. Afterwards the repeatability of the obtained results of the ELISA was tested. The intraassay coefficients showed a good repeatability. The interassay coefficients were not satisfying. One explanation was an insufficient stability of the coating antigen when partly used plates were stored at 4°C resp. frozen a second time. In comparison to other methods for detecting antibodies against FPV the ELISA was marginally less sensitive than indirect immunfluorescence and more sensitive than AGP. The investigation of sera from flocks that were exposed to natural infection with FPV for antibodies against FPV and REV showed a proportion of about 50 % with antibodies against FPV and a higher proportion with antibodies against REV. There were some differences between the flocks. A similar proportion of sera from flocks that were vaccinated against FPV had antibodies against FPV, but only in two of ten investigated flocks chickens had antibodies against REV. This makes clear, that the REV antibodies were induced by the integrated fvRP and not by an accidental coinfection with REV. This also shows that most of German FPV strains are able to induce antibodies against REV. Two experimental infection studies were done to investigate the humoral immune response against FPV and REV after intracutaneous infection with different in vitro passages of a field isolate and with the vaccine strain HP B. In both trials the low passaged field isolate with the integrated fvRP induced no antibodies against FPV. The proportion of birds with antibodies against REV varied depending on the infection dose. In contrast to that the vaccine strain induced antibodies against FPV in all birds but not against REV independently from the infecting dose. The highly passaged field isolate, in which the fvRP could not be found by PCR, induced antibodies against FPV only in a few birds and no antibodies against REV. So it was assumed, that the integrated fvRP contributes to the suppression of the antibody response against FPV after an infection with a field isolate. In the first trial the birds were reinfected after five weeks by intravenous application of the low passaged field isolate. About half the birds that previously had been infected with the field isolate developed antibodies against FPV. The proportion of birds with antibodies against REV increased marginally. The birds that had been vaccinated previously showed no antibody response against REV. The reason for this may be that the vaccination prevented the replication of the FPV field isolate and so the development of antibodies. After the intracutaneous infection with the low passaged field isolate and after the intravenous reinfection DNA specific for REV was detected in the peripheral blood mononuclear cells. FPV DNA could only be detected in one of all examined samples. This indicates that infectious REV virions can be formed from the FPV field isolate with integrated fvRP.